HPLC 分析 EEAI 活性成分
确定 A. indica 乙醇提取物中活性成分的组成和含量。
使用 HPLC-PAD 分析 EEAI，通过与标准品对照，鉴定 ovatodiolide、anisomelic acid 和 apigenin 并计算其在提取物中的浓度。
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Anisomeles indica 提取物及其成分在体内和体外抑制 ACE2 和 TMPRSS2 蛋白的表达
Anisomeles indica Extracts and Their Constituents Suppress the Protein Expression of ACE2 and TMPRSS2 In Vivo and In Vitro.
实验完整度
高包含体外细胞实验（HepG2、HEK293T）和体内小鼠模型，并涉及 Western blot、IHC、MTT、HPLC 等多层级验证，涵盖功能验证与部分机制验证。
主要模型
HepG2 细胞系 HEK 293T 细胞系 C57BL/6 小鼠模型
重点核对
EEAI 处理浓度（250 和 500 μg/mL） 蛋鸡成分处理浓度：ovatodiolide（5、10 μM），anisomelic acid（5、10 μM），apigenin（12.5、25 μM） 处理时间：24 小时 动物实验给药方案：500 mg/kg EEAI 口服灌胃，持续 14 天 检测指标：ACE2、TMPRSS2 蛋白表达（Western blot、IHC）及细胞活力（MTT）
摘要
由严重急性呼吸综合征冠状病毒 2 (SARS-CoV-2) 引起的 2019 年冠状病毒病 (COVID-19) 已产生深远的全球影响。这种高度传染性肺炎仍然是一个重大的持续威胁。关于该病毒对人类健康的影响仍存在不确定性，这凸显了治疗和预防的必要性。目前的研究强调血管紧张素转换酶 2 (ACE2) 和跨膜丝氨酸蛋白酶 2 (TMPRSS2) 是对抗 SARS-CoV-2 的关键靶点。病毒依靠 ACE2 进入细胞，并依靠 TMPRSS2 激活其刺突蛋白。抑制 ACE2 和 TMPRSS2 的表达有助于预防和治疗 SARS-CoV-2 感染。Anisomeles indica (L.) Kuntze 是中药中的一种药用植物，具有多种有前景的药理特性。在本研究中，对 A. indica 的乙醇提取物在体内 (250 和 500 μM) 和体外 (500 μM) 进行了检测。通过 Western blotting 分析，在 HepG2（人肝癌）细胞和 HEK 293T（人胚胎肾）细胞系中观察到 ACE2 和 TMPRSS2 蛋白表达水平显著降低，且未引起细胞损伤。还发现 A. indica 的主要成分，即 ovatodiolide（5 和 10 μM）、anisomelic acid（5 和 10 μM）和芹菜素（12.5 和 25 μM），具有相同的效果。此外，对小鼠肝、肾和肺组织的免疫组织化学分析表明，ACE2 和 TMPRSS2 蛋白表达水平降低。因此，本文提示 A. indica 及其成分具有降低 ACE2 和 TMPRSS2 蛋白表达水平的潜力，从而有助于预防 SARS-CoV-2 感染。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- A. indica 提取物及其成分是否能够调节 SARS-CoV-2 入侵宿主细胞所依赖的 ACE2 和 TMPRSS2 蛋白表达水平？
- 核心机制
- A. indica 提取物及其成分通过下调 ACE2 和 TMPRSS2 蛋白表达，降低病毒入侵宿主细胞的效率，从而发挥预防 SARS-CoV-2 感染的潜力。
- 主要证据
- 体外实验表明，EEAI 及其成分（ovatodiolide、anisomelic acid、apigenin）处理 HepG2 和 HEK293T 细胞后，Western blot 检测显示 ACE2 和 TMPRSS2 蛋白表达显著降低；体内实验表明，小鼠口服 EEAI 后，IHC 和 Western blot 显示肝、肾、肺组织中 ACE2 和 TMPRSS2 表达降低。
- 研究意义
- 该研究为 A. indica 及及其成分作为预防和治疗 SARS-CoV-2 感染的潜在药物提供了研究基础，为 COVID-19 防治提供了新的选择。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
MTT 测定细胞活力
评估 EEAI 及其成分对 HepG2 和 HEK293T 细胞的细胞毒性，以确定后续实验中的安全处理浓度。
将不同浓度的 EEAI（125-2000 μg/mL）及成分（ovatodiolide 2.5-20 μM，anisomelic acid 2.5-20 μM，apigenin 6.25-50 μM）处理细胞 24 小时，通过 MTT 法检测细胞活力。
Western blot 分析体外蛋白表达
检测 EEAI 及其成分处理后 HepG2 和 HEK293T 细胞中 ACE2 和 TMPRSS2 蛋白表达水平的变化。
用 EEAI（250、500 μg/mL）及成分（ovatodiolide、anisomelic acid、apigenin）处理细胞 24 小时后，使用Western blotting 检测 ACE2 和 TMPRSS2 蛋白表达，并以 β-actin 作为内参进行灰度分析。
评估体内效果
验证 EEAI 在体内对 ACE2 和 TMPRSS2 蛋白表达的调节作用。
对 C57BL/6 小鼠口服灌胃 500 mg/kg EEAI 14 天，然后通过 IHC 和 Western blot 检测肝、肾、肺组织中 ACE2 和 TMPRSS2 的表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 提取 | 95% 乙醇 | ECHO chemical CO., LTD. | -- |
| HPLC 分析 | ovatodiolide 标准品 | ARJIL Pharmaceuticals LLC Ltd. | -- |
| anisomelic acid 标准品 | ARJIL Pharmaceuticals LLC Ltd. | -- | |
| 芹菜素标准品 | Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd. | -- | |
| 乙酸 | Cascina Favaglie | -- | |
| TSK gel Tosoh ODS-80Tm 色谱柱 | Tosoh | -- | |
| 细胞培养 | DMEM 培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| RIPA 裂解液 | -- | -- | |
| MTT 实验 | MTT 试剂 | -- | -- |
| 二甲基亚砜 | -- | -- | |
| Western blot | Bio-Rad 蛋白定量试剂盒 | Bio-Rad | -- |
| PVDF 膜 | -- | -- | |
| ACE2 抗体 | Genetex | GTX101395 | |
| TMPRSS2 抗体 | Genetex | GTX100743 | |
| 山羊抗兔 IgG 抗体（HRP） | Arigo | ARG65351 | |
| ECL 底物 | Merck | -- | |
| Kodak Gel Logic 1500 成像软件 4.0 版本 | Eastman Kodak Company | -- | |
| 动物实验 | C57BL/6 小鼠 | BioLASCO | -- |
| 组织学检查 | 尼康显微镜 | Nikon | ECLIPSE |
| 显微镜相机 | Jenoptik | ProgRes | |
| 免疫组化 | ACE2 一抗 | Bioss Inc. | bs-1004R |
| TMPRSS2 一抗 | Abcam | ab214462 | |
| Polink-2 Plus HRP DAB 兔批量检测试剂盒 | GBI LABS | D39 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与处理 | 细胞系：HepG2 和 HEK293T；培养条件：DMEM 含 10% FBS，37°C，5% CO2；种板密度：2.5×10^5 cells/mL；处理时间：24 h 阅读提示：Materials and Methods, Section 4.3 |
| MTT 实验 | 细胞种板密度：2.5×10^5 cells/mL；药物处理时间：24 h；MTT 浓度：0.5 mg/mL；MTT 孵育时间：≥3 h；DMSO 作用 10 min；检测波长：570 nm 阅读提示：Materials and Methods, Section 4.4 |
| Western blot | 蛋白上样量：20 μg；一抗：ACE2 (GTX101395, 1:1500)、TMPRSS2 (GTX100743, 1:1500)；二抗：goat anti-rabbit IgG (HRP) (ARG65351, 1:5000)；使用 β-actin 作为内参 阅读提示：Materials and Methods, Section 4.5 |
| 动物实验 | 小鼠品系：C57BL/6，雄性，6-8 周龄，体重 18-20 g；分组：对照组和 EEAI 组，每组 n=6；给药剂量：500 mg/kg EEAI（溶于蒸馏水）；给药方式：口服灌胃；给药周期：14 天 阅读提示：Materials and Methods, Section 4.6 |
| 免疫组化 | 一抗稀释比例：ACE2 (bs-1004R) 1:50，TMPRSS2 (ab214462) 1:200；检测试剂盒：Polink-2 Plus HRP DAB Rabbit Bulk kit 阅读提示：Materials and Methods, Section 4.8 |