验证CLEC2D与TLR2的相互作用和二聚化
确定CLEC2D是否能与TLR2直接相互作用并形成同源或异源二聚体。
在HEK293T细胞中共表达CLEC2D-Flag和TLR2-Myc，进行免疫共沉淀；在BMDCs中检测内源性相互作用；使用BiFC和FRET验证二聚化；通过缺失突变体确定相互作用的结构域。
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C型凝集素受体2d形成同源二聚体并与TLR2形成异源二聚体，负调控IRF5介导的抗真菌免疫
C-type lectin receptor 2d forms homodimers and heterodimers with TLR2 to negatively regulate IRF5-mediated antifungal immunity.
实验完整度
高包含体外细胞共表达与免疫共沉淀、BiFC、FRET、定量配体结合实验、BMDC与RAW264.7细胞功能验证、体内小鼠感染模型、基因敲除小鼠及体内抗体中和实验，并明确机制验证（MyD88泛素化降解）。
主要模型
HEK293T细胞 骨髓来源树突状细胞（BMDCs） RAW264.7细胞 小鼠全身性白色念珠菌感染模型
重点核对
CLEC2D与TLR2的细胞外结构域对二者相互作用至关重要 CLEC2D同源或异源二聚体对β-葡聚糖的高结合能力 CLEC2D促进MyD88的K48连接泛素化和蛋白酶体依赖性降解 Clec2d缺陷小鼠对白色念珠菌感染的抵抗力依赖于IL-12和NK细胞 Smurf1抑制剂（Smurf1-IN-A01）完全阻断CLEC2D介导的MyD88降解
摘要
C型凝集素受体（CLRs）或Toll样受体（TLRs）的二聚化可以改变其配体结合能力，从而调节免疫应答。然而，CLRs与TLRs之间二聚化的可能性和作用仍不清楚。在此我们表明，C型凝集素受体2d（CLEC2D）形成同源二聚体，并与TLR2形成异源二聚体。定量配体结合实验揭示，CLEC2D同源二聚体和CLEC2D/TLR2异源二聚体对真菌来源的β-葡聚糖的结合能力均高于TLR2同源二聚体。此外，同源或异源二聚化的CLEC2D介导β-葡聚糖诱导的MyD88的泛素化和降解，从而抑制转录因子IRF5的活化及随后的IL-12产生。Clec2d缺陷的雌性小鼠对白色念珠菌（人类真菌病原体）感染具有抵抗力，这归因于IL-12产生的增加和随后产生IFN-γ的NK细胞的生成。总之，这些数据表明CLEC2D形成同源二聚体或与TLR2形成异源二聚体，通过抑制IRF5介导的IL-12产生而负调控抗真菌免疫。CLEC2D和TLR2的这些同源和异源二聚体为受体二聚化调节宿主针对微生物感染的先天免疫提供了一个范例。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CLEC2D是否与TLR2形成同源或异源二聚体，以及这些二聚体在抗真菌免疫中的调控作用及其机制。
- 核心机制
- CLEC2D形成同源二聚体或与TLR2形成异源二聚体，识别β-葡聚糖，促进Smurf1介导的MyD88的K48连接泛素化降解，进而抑制IRF5活化及其介导的IL-12产生，负调控抗真菌免疫。
- 主要证据
- 通过免疫共沉淀、BiFC、FRET验证二聚化；通过ELISA和流式细胞术验证配体结合；通过BMDCs和RAW264.7细胞实验显示Clec2d缺乏增强IRF5磷酸化和IL-12产生；通过小鼠感染模型显示Clec2d缺陷小鼠存活率提高，且依赖IL-12和NK细胞。
- 研究意义
- 该研究揭示了CLEC2D与TLR2形成同源或异源二聚体作为抑制性受体，通过抑制IRF5介导的IL-12产生负调控抗真菌免疫，为理解PRR二聚化调控宿主先天免疫提供了新范例，并可能为开发免疫治疗策略提供基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测CLEC2D及其二聚体对β-葡聚糖的配体结合能力
评估CLEC2D同源二聚体和CLEC2D/TLR2异源二聚体对真菌配体的结合特异性。
使用流式细胞术检测CLEC2D-Fc与白色念珠菌酵母的结合；ELISA检测CLEC2D-Fc、TLR2-His及其组合对curdlan、α-mannan和Pam3CSK4的结合；竞争实验使用Dectin-1-Fc。
研究CLEC2D对IRF5活化和MyD88降解的影响
阐明CLEC2D负调控β-葡聚糖诱导的IRF5活化的分子机制。
用curdlan刺激野生型、Clec2d缺陷、TLR2缺陷和双缺陷BMDCs以及稳定表达Clec2d的RAW264.7细胞，检测IRF5磷酸化、核转位和MyD88降解；使用MG132和MyD88抑制剂TJ-M2010-5验证蛋白酶体途径。
验证CLEC2D介导MyD88的K48连接泛素化
确定CLEC2D是否通过特定泛素连接酶介导MyD88的泛素化和降解。
在BMDCs中使用TUBE实验检测MyD88泛素化；在HEK293T细胞中共表达MyD88-His、Clec2d-Flag、Ub-HA或K48/K63连接泛素突变体，检测泛素化类型；使用Smurf1抑制剂和SPOP抑制剂处理RAW264.7细胞。
验证CLEC2D负调控IL-12产生
确认CLEC2D对β-葡聚糖诱导的IL-12产生的负调控作用及其依赖于IRF5和MyD88。
RNA-seq分析Clec2d缺陷BMDCs的差异表达基因；RT-qPCR检测Il12a和Il12b表达；ELISA检测IL-12p70和IL-12p40分泌；ChIP-qPCR检测IRF5与Il12a/Il12b启动子的结合；使用IRF5抑制剂N5-1和MyD88抑制剂TJ-M2010-5处理。
评估CLEC2D在小鼠白色念珠菌感染模型中的作用
确定CLEC2D在体内对宿主抗真菌免疫的影响。
对野生型和Clec2d缺陷小鼠静脉接种白色念珠菌SC5314，监测存活率、真菌载量、组织病理、细胞因子产生和NK细胞应答；使用IL-12中和抗体和IRF5抑制肽进行体内干预。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素 | -- | -- | |
| 链霉素 | -- | -- | |
| 胰蛋白酶 | -- | -- | |
| 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 | PeproTech | -- | |
| 细胞刺激 | 凝胶多糖 | Sigma-Aldrich | C7821 |
| α-甘露聚糖 | Sigma-Aldrich | M7504 | |
| Pam3CSK4 | Invivogen | tlrl-pms | |
| 蛋白检测 | MG132 | -- | -- |
| TJ-M2010-5 | -- | -- | |
| Smurf1-IN-A01 | -- | -- | |
| IRF5抑制肽N5-1 | GL Biochem | -- | |
| 对照肽PTD | GL Biochem | -- | |
| 流式分析 | 布雷菲德菌素A | Yeasen | 50502ES03 |
| FITC偶联抗CD45抗体 | Biolegend | 147710 | |
| PE偶联抗CD3抗体 | Biolegend | 100205 | |
| BV421偶联抗NK1.1抗体 | Biolegend | 108741 | |
| APC偶联抗IFN-γ抗体 | Biolegend | 505810 | |
| 免疫荧光 | 抗β-葡聚糖抗体 | Abcam | ab233743 |
| Dectin-1-Fc融合蛋白 | MedChemExpress | HY-P70101 | |
| CLEC2D-Fc融合蛋白 | -- | -- | |
| FITC标记的山羊抗人IgG1-Fc抗体 | Jackson ImmunoResearch | 109-095-190 | |
| 驴抗小鼠IgG H&L抗体 | Abcam | ab150108 | |
| 荧光增白剂 | -- | -- | |
| DAPI | -- | -- | |
| Cy5偶联TLR2抗体 | Bioss | bs-10472R-Cy5 | |
| Cy3偶联CLEC2D抗体 | Bioss | bs-2683R-Cy3 | |
| 免疫共沉淀 | Western和IP裂解液 | Beyotime | P0013 |
| 抗TLR2抗体 | Abcam | ab209217 | |
| 蛋白A/G磁珠 | -- | -- | |
| 串联泛素结合实体 | -- | -- | |
| RT-qPCR | Trizol试剂 | -- | -- |
| PrimeScript逆转录预混液 | Takara | RR036A | |
| Power SYBR Green PCR预混液 | -- | -- | |
| RNA-seq | miRvana RNA提取试剂盒 | Invitrogen | -- |
| TruSeq链特异性mRNA文库制备试剂盒 | Illumina | -- | |
| Agilent 2100生物分析仪 | Agilent Technologies | -- | |
| Illumina HiSeq 2500 / HiSeq X Ten测序平台 | Illumina | -- | |
| 动物实验 | 白色念珠菌SC5314 | ATCC | -- |
| 抗IL-12中和抗体 | BioXcell | BE0233 | |
| 抗NK1.1中和抗体 | BioXcell | BE0036 | |
| 同型对照抗体（IgG） | BioXcell | BE0090, | |
| 组织处理 | VI型胶原酶 | Roche | 11088866001 |
| Percoll分离液 | Cytiva | 17089109 | |
| 高速低温组织研磨机 | Servicebio | -- | |
| 沙保氏葡萄糖琼脂平板 | -- | -- | |
| 破膜缓冲液 | Invitrogen | 88-8824-00 | |
| Caseviewer软件 | -- | -- | |
| 显微成像 | 蔡司LSM880共聚焦激光扫描显微镜 | Zeiss | -- |
| FACSCelesta流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| 全自动化学发光/荧光图像分析系统（Tanon 5200s） | Tanon | 5200s | |
| Image J软件 | -- | -- | |
| GraphPad Prism 8软件 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 相互作用验证 | 免疫共沉淀和BiFC实验中的细胞系、转染组合、刺激条件及刺激时间 阅读提示：Methods: Co-immunoprecipitation, Bimolecular fluorescence complementation assay; Figure 1 |
| 配体结合实验 | 结合实验中的蛋白浓度、配体包被量、检测抗体及稀释度 阅读提示：Methods: In vitro ELISA binding assay, Immunofluorescence; Figure 2 |
| 信号通路分析 | BMDC和RAW264.7细胞刺激浓度与时间、抑制剂浓度、抗体稀释度 阅读提示：Methods: Stimulation of BMDCs and Raw264.7 cells, Western blot; Figure 3 |
| 体内感染模型 | 小鼠品系、年龄、性别、感染菌株及剂量、感染途径、取样时间点 阅读提示：Methods: Mouse model of systemic candidiasis, Fungal burden determination, Histology; Figure 6 |
| 体内干预实验 | 中和抗体（anti-IL-12、anti-NK1.1）或抑制剂（IRF5肽）的剂量、给药方式、给药时间 阅读提示：Methods: In vivo treatment with anti-IL-12 and anti-NK1.1 antibody, In vivo treatment with IRF5 peptide inhibitor N5-1; Figure 6,7 |