小鼠模型建立
获得携带sNASP突变的小鼠模型以研究其功能
通过基因编辑将sNASP外显子10的突变引入C57BL/6J小鼠，获得B6.∆sNASP小鼠；将B6.∆sNASP与B6.lpr杂交获得B6.∆sNASP.lpr小鼠。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
sNASP 突变通过 TAK1 通路加重 SLE 中 TLR4 介导的炎症
sNASP Mutation Aggravates to the TLR4-Mediated Inflammation in SLE by TAK1 Pathway.
实验完整度
中使用B6.∆sNASP.lpr、B6.∆sNASP及对照小鼠腹腔巨噬细胞，经LPS刺激，通过ELISA、qPCR和Western blot验证炎症因子表达及TLR4信号通路蛋白变化，包含功能验证但无体内实验。
主要模型
小鼠腹腔巨噬细胞 B6.∆sNASP.lpr小鼠模型 B6.∆sNASP小鼠模型
重点核对
小鼠品系：B6.∆sNASP.lpr、B6.∆sNASP及对照B6.lpr、B6.WT LPS刺激浓度：1、10、100 ng/ml LPS刺激时间：0/0.5/1/2小时 检测方法：ELISA检测IL-6、TNF-α蛋白，qPCR检测mRNA，Western blot检测信号通路蛋白 样本量：n=3（每个实验重复2–3次）
摘要
遗传因素在系统性红斑狼疮（SLE）的发病机制中发挥重要作用，异常的 Toll 样受体（TLR）信号通路与 SLE 的发生密切相关。在以往的研究中，我们发现小鼠狼疮易感位点 Sle2 中的突变体体细胞核自身抗原精子蛋白（sNASP）基因可促进狼疮模型小鼠的发病，但其机制尚不清楚。在本研究中，我们用不同浓度的脂多糖刺激小鼠腹腔巨噬细胞。结果表明，sNASP 基因突变可促进 TLR4–TAK1 信号通路的应答，但对 TLR4–TBK1 信号通路无明显影响。sNASP 突变增强了小鼠腹腔巨噬细胞中 TLR4 介导的核因子-κ-基因结合和丝裂原活化蛋白激酶激活以及 IL-6、肿瘤坏死因子的分泌。总之，我们的研究揭示了 sNASP 基因突变对小鼠腹腔巨噬细胞 TLR4 受体敏感性的影响，并阐明了自身免疫性疾病炎症的潜在机制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- sNASP基因突变是否以及如何影响TLR4信号通路，从而加重SLE相关的炎症反应？
- 核心机制
- sNASP突变通过促进TLR4–TAK1信号通路的激活，增强NF-κB和MAPK信号通路，进而增加促炎细胞因子IL-6和TNF-α的表达，但不影响TLR4–TBK1通路。
- 主要证据
- 在B6.∆sNASP.lpr和B6.∆sNASP小鼠腹腔巨噬细胞中，经LPS刺激后，IL-6和TNF-α的mRNA和蛋白水平较对照升高；p-TAK1、p-p65、p-p38等蛋白表达增加，而TBK1和p-IRF3无显著差异。
- 研究意义
- 该研究揭示了sNASP突变通过TLR4–TAK1通路增强TLR4敏感性，为理解SLE等自身免疫病的炎症机制提供了新见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
腹腔巨噬细胞分离与LPS刺激
观察sNASP突变对TLR4介导的炎症反应的影响
从小鼠腹腔获取原代巨噬细胞，用不同浓度LPS刺激不同时间，收集上清和细胞沉淀用于检测。
炎症因子表达检测
评估sNASP突变对TLR4诱导的细胞因子产生的影响
通过ELISA检测IL-6和TNF-α蛋白水平，通过qPCR检测其mRNA水平。
TLR4信号通路蛋白检测
探究sNASP突变影响的TLR4下游信号通路
通过Western blot检测TLR4–TAK1通路（p-TAK1、p-p65、p-p38、p-JNK、p-IκBα）和TLR4–TBK1通路（TBK1、p-IRF3）蛋白表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 药物处理 | 脂多糖（大肠杆菌0111:B4） | Sigma-Aldrich | -- |
| ELISA | 小鼠IL-6 ELISA试剂盒 | Invitrogen | 88-7064 |
| 小鼠TNF-α ELISA试剂盒 | Invitrogen | 88-7324 | |
| 小鼠IFN-α ELISA试剂盒 | Invitrogen | BMS6027 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Servicebio | G2002 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Servicebio | G2007 | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | P0012 | |
| 抗p-TAK1 (Ser439)抗体 | Boster Technology | P01458 | |
| 抗MAP3K7抗体 | Boster Technology | BM5328 | |
| 抗NAK/TBK1抗体 | Boster Technology | A00261-1 | |
| 抗p-JNK抗体 | Beyotime Technology | AF1762 | |
| 抗JNK抗体 | Beyotime Technology | AF1048 | |
| 抗p-p38抗体 | Beyotime Technology | AF5887 | |
| 抗p38抗体 | Beyotime Technology | AF1111 | |
| 抗IKB-α抗体 | Beyotime Technology | AF1282 | |
| 抗IRF3抗体 | Beyotime Technology | AF2485 | |
| HRP标记二抗 | Beyotime Technology | A0208 | |
| 抗TBK1/NAK (Ser172)抗体 | Cell Signaling Technology | 5483 | |
| 抗p-IKB-α (Ser32)抗体 | Cell Signaling Technology | 2859 | |
| 抗p-IRF3抗体 | Bioss Technology | bs-9278R | |
| 抗NASP抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-398379 | |
| 抗TRAF6抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-8409 | |
| RT-qPCR | RNAex pro试剂 | Accurate Biotechnology | AG21101-S |
| Evo M-MLV逆转录预混试剂盒 | Accurate Biotechnology | AG11706 | |
| 统计分析 | Origin 2021软件 | -- | -- |
| SPSS 26软件 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠模型 | 小鼠品系：B6.∆sNASP.lpr、B6.∆sNASP、B6.lpr、B6.WT；年龄：3月龄雌性；特定无病原体环境 阅读提示：Methods 2.1 Mice |
| 腹腔巨噬细胞分离与刺激 | 细胞来源：腹腔灌洗；细胞培养条件：RPMI 1640+12% FBS；37°C，5% CO2；细胞数：1×10^6/孔；LPS浓度：1、10、100 ng/ml；刺激时间：0/0.5/1/2小时 阅读提示：Methods 2.3 Acquisition of Peritoneal Macrophages and LPS Stimulation |
| 炎症因子检测 | ELISA检测IL-6、TNF-α；qPCR引物序列 阅读提示：Methods 2.4 ELISA 和 2.6 Real-Time RT-PCR |
| 信号通路蛋白检测 | Western blot检测p-TAK1、p-p65、p-p38、p-JNK、p-IκBα、TBK1、p-IRF3等蛋白水平；抗体信息 阅读提示：Methods 2.5 Western Blot |