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        单细胞转录组揭示糖尿病肾脏与视网膜病变之间的分子联系

        Single-cell transcriptomes reveal a molecular link between diabetic kidney and retinal lesions.

        作者信息Ying Xu, Zhidan Xiang, Weigao E, Yue Lang, Sijia Huang, Weisong Qin, Jingping Yang, Zhaohong Chen, Zhihong Liu
        PMID37670124
        期刊Commun Biol
        发布时间2023-09-05
        DOI10.1038/s42003-023-05300-4
        来源查看原文

        实验完整度

        高

        包含人类和小鼠单细胞转录组整合分析、体外细胞模型（AGEs处理）、体内动物模型（db/db小鼠）以及患者队列转录组和预后分析，多层验证支持。

        主要模型

        C57BLKS/J小鼠（野生型和db/db糖尿病模型） 人肾小球系膜细胞（HMCs） 人视网膜周细胞（HRPCs） 糖尿病肾病患者队列

        重点核对

        小鼠品系：C57BLKS/J背景的野生型和db/db小鼠，年龄21周 体外处理：100 μg/ml AGEs或BSA处理细胞6小时 细胞来源：人肾小球系膜细胞和人视网膜周细胞购自Cell Systems公司 患者队列：29例2型糖尿病肾病患者（14例并发DR，15例无DR）和20例健康对照 动物数量：肾脏每组n=3，视网膜每组n=8

        摘要

        糖尿病肾病（DN）和糖尿病视网膜病变（DR）在糖尿病患者中的发生密切相关。然而，DN和DR的细胞和分子联系尚未阐明，需要进一步揭示以改善相互的预后判断和管理。在这里，我们生成并整合肾脏和视网膜的单细胞RNA测序图谱，以探索肾脏和视网膜在生理和病理条件下的细胞和分子关联。我们发现肾系膜细胞和视网膜周细胞共享分子特征，并在糖尿病条件下经历相似的分子转变。此外，我们发现两种细胞类型共享的趋化因子调节对DN和DR的共存至关重要，趋化因子评分可用于DN并发DR的预后。这些发现阐明了DN和DR共存的机制，并可能改善糖尿病微血管并发症的预防和治疗。

        实验结论

        提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。

        研究问题
        糖尿病肾病和糖尿病视网膜病变共存的细胞和分子基础是什么？
        核心机制
        肾系膜细胞和视网膜周细胞在糖尿病条件下共享趋化因子产生的上调，这可能是连接DN和DR的分子机制。
        主要证据
        整合人类肾脏和视网膜单细胞转录组显示MCs和RPCs聚类在一起；小鼠scRNA-seq和免疫荧光证实共享标记；体外AGEs处理诱导趋化因子表达上调；患者转录组显示DN+DR组趋化因子评分升高。
        研究意义
        研究提供了DN和DR共存的细胞和分子机制的新视角，趋化因子评分可作为DN并发DR的预后生物标志物，为早期诊断和治疗提供潜在靶点。

        研究路径

        按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

        1

        人类肾脏和视网膜单细胞转录组整合分析

        探索肾脏和视网膜在细胞水平上的关联，并识别共享分子特征的细胞类型。

        整合健康人类肾脏（GSE140989）和视网膜（GSE142449）的scRNA-seq数据，经质量控制、批次效应去除和聚类分析，共鉴定47个簇，涵盖肾脏和视网膜的主要细胞类型。

        2

        小鼠生理和糖尿病条件下肾小球和视网膜血管的scRNA-seq

        验证MCs和RPCs在生理和糖尿病条件下的相似性及共同分子转变。

        从21周龄野生型（C57BLKS/J）和db/db小鼠中分离肾小球和视网膜血管细胞，进行scRNA-seq分析。生理条件下，MCs和RPCs共享标记基因，如CSPG4；糖尿病条件下，两者均上调ECM-受体相互作用和PI3K-Akt信号通路相关基因，并发生胶原重塑。

        3

        体外验证HMCs和HRPCs对AGEs的反应

        排除体内其他细胞影响，验证糖尿病条件（AGEs）下HMCs和HRPCs共享的转录变化和趋化因子上调。

        培养HMCs和HRPCs，用100 μg/ml AGEs或BSA（对照）处理6小时，进行bulk RNA-seq、实时PCR和ELISA检测趋化因子。

        4

        糖尿病肾病患者肾小球转录组分析及趋化因子评分

        评估趋化因子评分对DN并发DR的区分和预后价值。

        利用29例DN患者（14例并发DR，15例无DR）和20例健康对照的肾小球微阵列数据，进行GSEA和趋化因子评分计算（ssGSEA），并比较各组评分，使用ROC曲线评估区分能力。

        研究方法

        按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。

        验证样本或模型特征
        免疫荧光染色过碘酸-雪夫染色苏木精-伊红染色
        验证细胞功能变化
        细胞培养和处理
        验证分子表达变化
        实时PCR酶联免疫吸附试验蛋白质印迹
        验证免疫效应
        流式细胞术
        验证机制链路
        基因集富集分析KEGG通路富集分析基因本体富集分析
        评估体内效果
        小鼠模型（db/db）视网膜荧光灌注
        数据分析与统计
        单细胞RNA测序分析受试者工作特征曲线线性混合效应模型

        产品清单

        实验环节名称品牌货号
        细胞培养DMEM培养基Thermo Fisher Scientific--
        胎牛血清Thermo Fisher Scientific--
        药物处理晚期糖基化终末产物（AGEs）Biossbs-1158p
        牛血清白蛋白Sigma AldrichV900933
        逆转录PrimeScript RT预混液TakaraRR036A
        实时PCR7900HT序列检测系统Applied Biosystems--
        免疫荧光兔抗PDGFRB抗体Abcamab32570
        兔抗αSMA抗体Abcamab32575
        兔抗RGS5抗体Abcamab196799
        兔抗CXCL1抗体Proteintech12335-1-AP
        兔抗CXCL3抗体ImmunoWayYT2075
        FITC标记兔抗人IgG(H+L)Beyotime BiotechnologyA0562
        Cy3标记山羊抗大鼠IgG(H+L)Beyotime BiotechnologyA0521
        含Hoechst 33342的抗荧光淬灭封片剂Beyotime BiotechnologyP0133
        小鼠抗CSPG4抗体Santa Cruzsc-33666
        兔抗COL4A1抗体Abcamab236640
        Zeiss LSM710共聚焦显微镜Zeiss--
        ELISAELISA试剂盒BOSTER, MULTI SCIENCESEK0722, EK0728, EK0359, EK0413, EK1264, EK1265
        动物实验Albuwell M尿白蛋白检测试剂盒Exocell1011
        肌酐检测试剂盒Bioassay Systemsdict-500
        肾小球分离Dynabeads磁珠Thermo Fisher Scientific14013
        胶原酶IIThermo Fisher ScientificC6885
        蛋白酶EThermo Fisher ScientificP6911
        脱氧核糖核酸酶IThermo Fisher ScientificD5025
        视网膜细胞分离PE标记抗小鼠CD140b抗体BioLegend136006
        PE标记抗血小板和内皮细胞粘附分子1（PECAM1）抗体eBioscience160204
        顺磁微珠偶联抗PE抗体Miltenyi Biotec130-048-801
        单细胞RNA测序Chromium单细胞3' V3试剂盒10x GenomicsPN-1000075
        HiSeqX Ten系统Illumina--
        bulk RNA测序Qubit 3.0荧光计Thermo Fisher Scientific--
        Agilent 2100生物分析仪Agilent Technologies--
        高灵敏度DNA试剂盒Agilent Technologies--
        HiSeq3000平台Illumina--
        视网膜荧光灌注FITC标记的牛血清白蛋白Sigma-AldrichFD2000S

        关键环节

        汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

        环节核对要点
        动物模型
        小鼠品系（C57BLKS/J）、性别（雄性）、年龄（21周）、饲养条件（恒温恒湿，12小时光暗周期）、体重和血糖监测
        阅读提示：Methods - Animals
        细胞分离与单细胞制备
        肾小球分离（Dynabeads灌注、胶原酶II、蛋白酶E、DNase I消化及条件）、视网膜分离（胶原酶II和DNase I消化，磁珠分选抗CD140b和抗PECAM1）
        阅读提示：Methods - Isolation of glomeruli and retinas and single-cell preparation
        体外细胞处理
        细胞来源（HMCs和HRPCs）、培养基（DMEM+10%FBS）、血清饥饿（0.5%FBS过夜）、AGEs和BSA浓度（100 μg/ml）及处理时间（6小时）
        阅读提示：Methods - Cell culture and treatment
        单细胞RNA测序数据分析
        质量控制标准（>200基因，<5000基因，<30%线粒体RNA）、聚类参数（2000个高变基因，前50个PC）、批次校正（Harmony）
        阅读提示：Methods - ScRNA-seq data processing and quality control, scRNA-seq bioinformatics analysis
        患者队列分析
        DN患者诊断和分组（并发DR与否）、样本量（29 DN，20对照）、肾小球微阵列数据来源、趋化因子评分计算方法（ssGSEA）
        阅读提示：Methods - Human RNA-seq data sources and analysis

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