C1GalT1敲低模型的建立与糖基化变化验证
验证C1GalT1敲低对细胞O-糖基化（TF和Tn抗原）的影响
使用shRNA转染人结肠癌细胞SW620和HCT116F3，通过凝集素印迹和流式细胞术检测TF和Tn表达。
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C1GalT1表达通过galectin-3和MGL双向调控肿瘤细胞间及肿瘤-巨噬细胞相互作用，对癌症发展和进展具有双重影响
C1GalT1 expression reciprocally controls tumour cell-cell and tumour-macrophage interactions mediated by galectin-3 and MGL with double impact on cancer development and progression.
实验完整度
高包含细胞系功能实验（增殖、迁移、粘附、集落形成）、体外共培养、鸡胚体内模型及转基因小鼠模型，并进行了机制验证（受体提取和质谱分析）。
主要模型
人结肠癌细胞系SW620和HCT116F3（C1GalT1敲低及对照） THP-1单核细胞分化的M1和M2巨噬细胞 鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）肿瘤模型 乳腺上皮特异性C1galt1敲除小鼠（ME C1galt1-/-/Erb）与对照（C1galt1f/f/Erb）
重点核对
C1GalT1敲低效率（SW620 93%，HCT116F3 73%） 流式检测galectin-3和MGL结合的细胞系及处理条件 巨噬细胞分化方案（PMA、IFN-γ/LPS、IL-4）及标志物验证 鸡胚模型细胞植入量（1.8×10^6细胞）及galectin-3浓度（5μg） 转基因小鼠模型构建（C1galt1f/f与MMTV-Cre、MMTV-ErbB2杂交）
摘要
尽管大多数细胞膜蛋白都经过糖基化修饰，但我们对蛋白质糖基化的作用和机制的理解仍然非常有限。β1,3半乳糖基转移酶（C1GalT1）是控制O-连接黏蛋白型聚糖Core 1结构生物合成的关键糖基转移酶，在许多常见类型的上皮癌中过表达。本研究报告，在人结肠癌细胞中抑制C1GalT1表达引起了细胞膜蛋白糖基化的显著变化，其中许多是半乳糖苷结合的半乳凝素-3和巨噬细胞半乳糖型凝集素（MGL）的配体。这导致癌细胞增殖、粘附、迁移和形成集落的能力显著降低。重要的是，C1GalT1抑制显著减少了galectin-3介导的肿瘤细胞-细胞相互作用以及galectin-3促进的肿瘤细胞活性。同时，C1GalT1抑制大幅增加了MGL介导的巨噬细胞-肿瘤细胞相互作用以及巨噬细胞-肿瘤细胞吞噬作用和细胞因子分泌。表达C1GalT1的癌细胞植入鸡胚后形成的肿瘤显著大于C1GalT1抑制的细胞，且galectin-3的存在增加了C1GalT1表达细胞的肿瘤生长，但对C1GalT1抑制细胞无此作用。在ME C1galt1-/-/Erb小鼠中，观察到更多表达MGL的巨噬细胞和树突状细胞被吸引到肿瘤微环境，相较于C1galt1f/f/Erb小鼠。这些结果表明，肿瘤细胞表达的C1GalT1通过galectin-3和MGL双向调控肿瘤细胞-细胞和肿瘤-巨噬细胞相互作用，对癌症发展和进展具有双重影响。因此，上皮癌中C1GalT1的过表达可能代表癌症促进和减少癌症进展中免疫反应/监视的基本机制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- C1GalT1表达的改变如何影响肿瘤细胞与galectin-3和MGL的相互作用，进而影响癌症发展和进展。
- 核心机制
- C1GalT1表达通过控制TF和Tn抗原的生成，双向调节galectin-3介导的肿瘤细胞-细胞相互作用和MGL介导的肿瘤-巨噬细胞相互作用：高表达C1GalT1促进galectin-3介导的肿瘤细胞存活和生长，同时减少MGL介导的免疫监视。
- 主要证据
- 体外细胞功能实验、流式细胞术、共培养实验、鸡胚模型和转基因小鼠模型。
- 研究意义
- 上皮癌中C1GalT1过表达可能代表癌症促进和降低免疫监视的基本机制，为癌症治疗提供潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
肿瘤细胞行为学检测
评估C1GalT1敲低对肿瘤细胞增殖、迁移、粘附和集落形成的影响
通过MTT、伤口愈合、粘附实验和集落形成实验检测细胞行为。
galectin-3和MGL结合及功能验证
验证C1GalT1敲低对galectin-3和MGL结合及其介导的肿瘤细胞行为的影响
用流式细胞术检测galectin-3和MGL结合，并评估galectin-3介导的细胞聚集、粘附和EGFR激活。
巨噬细胞分化与相互作用分析
评估C1GalT1敲低对肿瘤细胞与巨噬细胞相互作用及巨噬细胞功能的影响
THP-1分化为M1和M2巨噬细胞，通过共培养检测异型聚集、吞噬和细胞因子分泌。
体内肿瘤生长模型
验证C1GalT1表达对体内肿瘤生长的影响
将GFP标记的SW620shCon和shC1GT细胞植入鸡胚CAM，测量肿瘤大小；并分析转基因小鼠肿瘤微环境中的免疫细胞浸润。
蛋白相互作用网络分析
鉴定galectin-3和MGL的细胞膜结合蛋白，揭示C1GalT1改变的影响
通过免疫沉淀提取galectin-3和MGL结合蛋白，质谱鉴定。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫印迹 | C1GalT1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-100745 |
| p-EGFR抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-377547 | |
| 凝集素印迹 | 生物素化花生凝集素 | Vector Lab | B-1075 |
| 生物素化绒毛卷柏凝集素 | Vector Lab | B-1235-2 | |
| 生物素化山槐凝集素II | Vector Lab | B-1265-1 | |
| 生物素化接骨木凝集素 | Vector Lab | B-1305-2 | |
| 生物素化双花扁豆凝集素II | Vector Lab | B-1215-2 | |
| 免疫印迹 | EGFR抗体 | Cell Signalling Technology | 4267S |
| 细胞增殖 | CellTiter 96非放射性细胞增殖检测试剂盒 | Promega | -- |
| 细胞活力 | CellTiter-Glo发光细胞活力检测试剂盒 | Promega | -- |
| 蛋白结合 | 重组人CLEC10A/CD301 | R & D Systems | -- |
| 流式细胞术 | 抗人/小鼠CLEC10A/CD301单克隆抗体 | R & D Systems | AF4888 |
| 蛋白结合 | 人galectin-3生物素化抗体 | R & D Systems | BAF1154 |
| 细胞迁移 | 三孔培养插入式培养皿 | Ibidi GmbH | -- |
| 细胞粘附 | Matrigel基底膜基质（无酚红） | CORNING | -- |
| 巨噬细胞分化 | 佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯 | Sigma-Aldrich | -- |
| 大肠杆菌O111:B4脂多糖 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 免疫印迹 | 肌动蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | A2066 |
| 细胞因子处理 | 重组人干扰素-γ | PeproTech | -- |
| 重组人白细胞介素-4 | PeproTech | -- | |
| 重组人表皮生长因子 | PeproTech | -- | |
| 细胞标记 | Vybrant DiO细胞标记溶液 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Vybrant DiI细胞标记溶液 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 流式细胞术 | PE-CD68抗体 | Thermo Fisher Scientific | 12-0689-42 |
| PE-CD86抗体 | Thermo Fisher Scientific | 12-0869-41 | |
| PE-EGR2抗体 | Thermo Fisher Scientific | 12-6691-82 | |
| 免疫组化 | F4/80抗体 | Thermo Fisher Scientific | 14-4801-82 |
| CD11c抗体 | Thermo Fisher Scientific | 14-0114-82 | |
| 免疫组织化学 | C1GalT1多克隆抗体 | Bioss | BS-9685R |
| 蛋白提取 | 无EDTA蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | -- |
| 动物实验 | 受精的Shaver Brown母鸡蛋 | Henry Stewart & Co. Ltd | -- |
| 细胞培养 | McCoy's 5A glutaMAX培养基 | -- | -- |
| DMEM glutaMAX培养基 | -- | -- | |
| RPMI1640培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 基因敲低 | Core 1半乳糖基转移酶shRNA质粒DNA | Sigma Aldrich | TRCN0000289384 |
| 对照shRNA | Sigma Aldrich | SHC002v | |
| 流式细胞术 | FITC标记的亲和素 | -- | -- |
| 免疫印迹 | SuperSignal West Dura Extended Duration底物 | Thermo Scientific | -- |
| Molecular Imager Gel Doc XR系统 | Bio-Rad | -- | |
| 流式细胞术 | BD FACSCanto流式细胞仪 | BD | -- |
| 细胞增殖 | Sunrise酶标仪 | Tecan | -- |
| 细胞迁移 | Zeiss Axiovert 25倒置相差显微镜 | Zeiss | -- |
| 细胞粘附 | Leica荧光显微镜 | Leica | -- |
| 细胞因子分泌 | Tecan GENios酶标仪 | Tecan | -- |
| 慢病毒包装 | pLNT-SFFV-EGFP载体 | -- | -- |
| pMD2.G包膜质粒 | -- | -- | |
| psPAX2包装质粒 | -- | -- | |
| 动物实验 | OvaEasy 380 Advance Series II孵化器 | Brinsea | -- |
| 免疫组织化学 | Leica RM2255切片机 | Leica | -- |
| DAB液体底物系统四盐酸盐 | SIGMA | -- | |
| Leica DMLA显微镜 | Leica | -- | |
| 质谱分析 | Ultimate 3000 RSLC纳升系统 | Thermo Scientific | -- |
| Q Exactive质谱仪 | Thermo Scientific | -- | |
| PepMap100 C18捕集柱 | Thermo Scientific | -- | |
| Easy-Spray C18分析柱 | Thermo Scientific | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| C1GalT1敲低细胞系建立 | shRNA序列及转染效率，细胞系来源 阅读提示：Materials and methods: Cell lines |
| 凝集素印迹和流式细胞术 | 抗体和凝集素的浓度，孵育时间，洗涤次数 阅读提示：Materials and methods: Lectin/Immuno-blotting, Flow cytometry |
| 巨噬细胞分化 | PMA、IFN-γ、LPS、IL-4的浓度和处理时间 阅读提示：Materials and methods: THP-1 monocyte macrophage differentiation |
| 细胞-细胞相互作用 | 细胞浓度、DiO/DiI标记时间、galectin-3浓度、孵育时间 阅读提示：Materials and methods: Cancer cell-cell and cancer cell-macrophage interactions |
| 鸡胚肿瘤模型 | 细胞植入数量、galectin-3剂量、植入时间、肿瘤测量时间 阅读提示：Materials and methods: Tumour growth in Chick embryo |
| 免疫组织化学 | 抗体浓度、抗原修复条件、染色时间 阅读提示：Materials and methods: Immunohistochemistry |