化合物库筛选
鉴定具有抗ASFV活性的先导化合物。
使用CCK-8评估102种化合物的细胞毒性，并通过抗ASFV活性测定筛选出包括DHM在内的17种活性化合物。
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二氢杨梅素通过下调Toll样受体4依赖性细胞焦亡在体外抑制非洲猪瘟病毒复制
Dihydromyricetin inhibits African swine fever virus replication by downregulating toll-like receptor 4-dependent pyroptosis in vitro.
实验完整度
高包含体外抗病毒筛选、剂量和时间依赖性实验、时间添加实验、机制研究（TLR4/MyD88/MAPK/NF-κB通路、ROS/NLRP3炎症小体/焦亡）以及siRNA和激动剂/抑制剂回补实验等多个独立证据层级。
主要模型
猪肺泡巨噬细胞（PAMs） ASFV GZ201801 感染的 PAMs PRRSV NADC-30 感染的 PAMs SIV H1N1 感染的 PAMs
重点核对
化合物浓度（如DHM 25-100 μM） 感染复数（MOI）为1 处理时间（如24、48、72小时） TLR4抑制剂（resatorvid）或siRNA处理
摘要
非洲猪瘟（ASF）由非洲猪瘟病毒（ASFV）感染引起，由于缺乏有效的防控措施，对养猪业构成巨大威胁。因此，迫切需要制定包括靶向ASFV的抗病毒药物在内的策略，以防止ASFV传播。本研究旨在鉴定具有抗ASFV活性的新型化合物。为此，我们筛选了一个包含102种化合物的小型化学库，其中天然黄酮类化合物二氢杨梅素（DHM）表现出最强的抗ASFV活性。DHM处理以剂量和时间依赖性方式抑制ASFV复制。此外，它抑制了猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪流感病毒的复制，这表明DHM具有广谱抗病毒作用。机制上，在时间添加试验中，DHM处理通过多种方式抑制ASFV复制，包括预处理、共处理和后处理。此外，DHM处理通过调节TLR4/MyD88/MAPK/NF-κB信号通路降低了ASFV诱导的炎症介质水平。同时，DHM处理减少了ASFV诱导的活性氧积累，通过抑制ASFV诱导的NLRP3炎症小体激活进一步减少细胞焦亡。有趣的是，DHM对ASFV的作用可被皂苷VI（一种焦亡激动剂）和RS 09 TFA（一种TLR4激动剂）部分逆转，表明DHM通过调节TLR4信号抑制焦亡。此外，用瑞沙托维（一种TLR4特异性抑制剂）和靶向TLR4的小干扰RNA处理可抑制ASFV复制。总之，这些结果揭示了DHM的抗ASFV活性及其作用机制，为开发靶向ASFV的抗病毒药物提供了潜在候选化合物。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 筛选具有抗ASFV活性的新型化合物，并探讨其作用机制。
- 核心机制
- DHM通过下调TLR4/MyD88/MAPK/NF-κB信号通路，减少ASFV诱导的炎症因子，并抑制ROS-NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡。
- 主要证据
- 在PAMs中，DHM剂量和时间依赖性抑制ASFV复制；TLR4抑制剂和siRNA抑制ASFV复制；聚phyllin VI和RS 09 TFA可部分逆转DHM的作用。
- 研究意义
- 为开发靶向ASFV的抗病毒药物提供实验依据和潜在候选化合物。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
DHM抗ASFV活性测定
验证DHM对ASFV复制的抑制作用。
在不同浓度DHM处理后，检测ASFV p30蛋白表达、病毒滴度和B646L转录水平。
时间添加实验和直接灭活实验
确定DHM抑制ASFV复制的阶段。
在ASFV感染前、同时或后加入DHM，检测病毒复制；另将ASFV与DHM混合后分离，检测直接灭活作用。
TLR4/MyD88信号通路验证
验证DHM是否通过下调TLR4/MyD88信号抑制ASFV。
检测ASFV感染和DHM处理后TLR4、MyD88蛋白和mRNA水平；使用TLR4抑制剂resatorvid和siRNA处理验证。
MAPK/NF-κB通路验证
验证DHM是否通过调节MAPK/NF-κB通路抑制炎症因子。
检测ASFV感染和DHM处理后p-P38、p-ERK、p-p65水平及IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α mRNA水平。
ROS和NLRP3炎症小体验证
验证DHM是否通过抑制ROS和NLRP3炎症小体激活减少焦亡。
用DCFH-DA检测ROS水平，并用EUK-134处理；检测NLRP3、ASC、caspase-1蛋白和mRNA表达。
细胞焦亡验证
验证DHM是否抑制ASFV诱导的细胞焦亡。
检测GSDMD和GSDMD-N表达，使用焦亡抑制剂disulfiram和激动剂polyphyllin VI处理，以及TLR4激动剂RS 09 TFA处理。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素 | -- | -- | |
| 链霉素 | -- | -- | |
| L-谷氨酰胺 | -- | -- | |
| 细胞活性检测 | 细胞计数试剂盒-8 | -- | -- |
| 酶标仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 免疫荧光 | Triton X-100 | -- | -- |
| 牛血清白蛋白 | -- | -- | |
| ASFV p30抗体 | -- | -- | |
| Alexa Fluor 568 | -- | -- | |
| DAPI | -- | -- | |
| Leica DMI 4000 B荧光显微镜 | Leica | -- | |
| 病毒灭活实验 | 超滤离心管（100 nm孔径） | Sigma-Aldrich | -- |
| Western blotting | RIPA裂解液 | Beyotime Biotechnology | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime Biotechnology | -- | |
| 抗Actin抗体（AF0003） | Beyotime Biotechnology | AF0003 | |
| 抗TLR4抗体（293,072） | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | 293072 | |
| 抗MyD88抗体（TA5195S） | Abmart | TA5195S | |
| 抗p-p65抗体（3033T） | Cell Signaling Technology | 3033T | |
| 抗p-P38抗体（4511T） | Cell Signaling Technology | 4511T | |
| 抗p-ERK抗体（4370T） | Cell Signaling Technology | 4370T | |
| 抗NLRP3抗体（M035175S） | Abmart | M035175S | |
| 抗ASC抗体（bs-6741R） | Bioss | bs-6741R | |
| 抗caspase-1抗体（22915-1-AP） | Proteintech | 22915-1-AP | |
| 抗GSDMD抗体（20770-1-AP） | Proteintech | 20770-1-AP | |
| 抗GSDMD-N抗体（DF12275） | Affinity Biosciences | DF12275 | |
| 山羊抗小鼠或抗兔二抗 | LI-COR Biosciences | -- | |
| Tanon-5200多红外成像系统 | Shanghai Tianneng Technology Co., Ltd. | -- | |
| RT-qPCR | 总RNA快速提取试剂盒 | Fastagen | -- |
| 逆转录试剂盒 | TaKaRa | -- | |
| SYBR qPCR预混液 | Vazyme | -- | |
| Bio-Rad CFX96系统 | Bio-Rad Laboratories | -- | |
| ROS检测 | DCFH-DA | -- | -- |
| siRNA转染 | riboFECT™ CP转染试剂 | RiboBio | -- |
| 药物处理 | 瑞沙托维 | MedChemExpress | -- |
| EUK-134 | MedChemExpress | -- | |
| RS 09 TFA | MedChemExpress | -- | |
| 皂苷VI | MedChemExpress | -- | |
| 双硫仑 | MedChemExpress | -- | |
| 二氢杨梅素 | Chengdu Chroma Biotechnology Co., Ltd. | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | PAMs分离自4周龄SPF猪；培养基为RPMI-1640添加10% FBS、青霉素、链霉素和L-谷氨酰胺。 阅读提示：Materials and methods: Cells, viruses, and test compounds |
| 药物处理 | DHM浓度（25-100 μM）和感染复数（1 MOI）。 阅读提示：Results: DHM treatment suppressed ASFV replication in PAMs; Figure 2 |
| 时间添加实验 | 预处理（感染前2小时）、共处理（感染同时）和后处理（感染后2小时）时间。 阅读提示：Materials and methods: Time-of-addition assay; Figure 3 |
| 机制验证 | TLR4抑制剂resatorvid浓度、siTLR4转染浓度（50 nM）和转染时间（36小时）。 阅读提示：Materials and methods: Small interfering RNA treatment; Results: DHM downregulated the ASFV-induced TLR4/MyD88 signaling; Figure 4 |
| ROS和焦亡检测 | DCFH-DA浓度（10 μM）和处理时间（30分钟）。 阅读提示：Materials and methods: Determination of reactive oxygen species (ROS) levels |