出生时注射维生素A可改善羔羊肌肉生长

Vitamin A injection at birth improves muscle growth in lambs.

作者信息Pengkang Song, Xiaoyou Chen, Jiamin Zhao, Qiang Li, Xinrui Li, Yu Wang, Bo Wang, Junxing Zhao
PMID37484991
期刊Anim Nutr
发布时间2023-06-01
DOI10.1016/j.aninu.2023.05.011

实验完整度

包含动物实验(羔羊体内注射和屠宰采样)、组织学分析(H&E染色)、免疫组化、原代细胞分离和体外分化实验,以及分子生物学检测(qRT-PCR、Western blot),多层次验证。

主要模型

新生羔羊(Hu羊) 羔羊原代骨骼肌单核细胞 体外生肌分化模型

重点核对

维生素A注射剂量和频率(7500 IU,每周1次,从出生至3周龄共4次) 对照组(玉米油)和维生素A组的样本量(每组8只羔羊) 肌纤维直径测量方法(H&E染色,每样本≥200个肌纤维,至少3次重复) 细胞分化条件(2%马血清,分化3天和6天) qRT-PCR的内参基因(β-actin)和定量方法(2-△△Ct)

摘要

维生素A及其代谢产物视黄酸在调节骨骼肌发育中起重要作用。本研究旨在探讨早期肌肉注射维生素A对羔羊肌肉生长的影响。选取16只新生羔羊,从出生至3周龄,每周肌肉注射玉米油(对照组,n = 8)或7500 IU维生素A棕榈酸酯(维生素A组,n = 8),共注射4次。在3周龄和断奶时采集股二头肌样本,分析维生素A对骨骼肌细胞生肌能力的影响。所有羔羊在8月龄时屠宰。结果表明,维生素A处理加快了羔羊的生长速度,并增加了眼肌面积(P < 0.05)。一致地,维生素A增加了胸最长肌肌纤维直径(P < 0.01)并提高了羔羊的最终体重(P < 0.05)。维生素A注射未改变蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白和肌生成抑制素信号(P > 0.05)。此外,维生素A上调了PAX7(P < 0.05)以及生肌标记基因包括MYOD和MYOG的表达(P < 0.01)。来自维生素A处理羔羊的骨骼肌来源单核细胞在体外诱导生肌分化时表现出更高的生肌基因表达(P < 0.05)并形成更多肌管(P < 0.01)。此外,体外分析表明,视黄酸在前3天促进了骨骼肌来源单核细胞的生肌分化(P < 0.05),但在后期未促进(P > 0.05),这通过生肌基因表达和融合指数得以证实。综上,新生期肌肉注射维生素A通过促进卫星细胞的生肌潜能来促进羔羊肌肉生长。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
新生期肌肉注射维生素A是否能促进羔羊的肌肉生长及其潜在机制是什么?
核心机制
维生素A通过上调PAX7表达并促进卫星细胞的生肌潜能(增加生肌基因表达和肌管形成)来促进肌肉生长,而非通过激活Akt/mTOR信号通路或改变肌生成抑制素信号。
主要证据
体内实验显示维生素A注射提高羔羊生长速率、眼肌面积和肌纤维直径,并上调PAX7、MYOD和MYOG表达;体外实验显示维生素A处理羔羊的骨骼肌单核细胞在诱导分化时生肌基因表达更高并形成更多肌管。
研究意义
新生期维生素A注射是一种经济有效的促进家畜肌肉生长的营养策略,可能对 livestock 生产者有用。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

动物处理与分组

评估新生期肌肉注射维生素A对羔羊生长性能的影响。

选取16只新生羔羊,随机分为对照组(玉米油)和维生素A组(7500 IU维生素A棕榈酸酯),从出生后第2天起每周注射1次,共4次。记录体重、采食量,并在8月龄屠宰。

2

肌肉组织采样与组织学分析

分析维生素A对肌纤维大小和卫星细胞数量的影响。

在3周龄、12周龄和8月龄采集肌肉样本,进行H&E染色测量肌纤维直径,免疫组化染色检测PAX7阳性细胞。

3

基因和蛋白表达分析

检测维生素A对生肌基因和蛋白表达的影响。

提取肌肉组织RNA和蛋白,通过qRT-PCR检测PAX7、MYF5、MYOD、MYOG表达,Western blot检测MYOD、MYOG、Akt/mTOR信号和MSTN蛋白。

4

原代肌细胞分离和体外分化

验证维生素A对卫星细胞生肌潜能的影响及视黄酸的作用阶段。

从肌肉组织分离单核细胞,诱导分化并检测肌管形成和生肌基因表达;用视黄酸处理细胞不同时间段(0-3天、4-6天、0-6天)观察其作用。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
维生素A棕榈酸酯SigmaPHR1235
玉米油SigmaC8267
切片机Leica--
显微镜(DMi8)LeicaDMi8
冷冻切片机(Leica CM1950)LeicaCM1950
抗PAX7抗体DSHBAB_528428
I型胶原酶----
DMEM培养基----
胎牛血清----
Matrigel基质胶----
马血清----
抗肌球蛋白重链抗体DSHBAB2147781
抗小鼠二抗Cell Signaling4408
DAPIVector Lab--
Trizol试剂Sigma--
反转录试剂盒TAKARA--
SYBR Green RT-PCR试剂盒TAKARA--
RIPA裂解液----
原钒酸钠Sigma450243
β-巯基乙醇SigmaM6250
蛋白酶抑制剂SolarbioA8260
硝酸纤维素膜----
脱脂奶粉Sangon Biotech--
Odyssey红外成像系统LI-COR Biosciences--
抗AKT抗体Cell Signaling92728
抗磷酸化AKT抗体Cell Signaling4060S
抗mTOR抗体Cell Signaling2972
抗磷酸化mTOR抗体Cell Signaling2971
抗4EBP1抗体Cell Signaling9644
抗磷酸化4EBP1抗体Cell Signaling2855
抗p70 S6激酶抗体Cell Signaling2708
抗磷酸化p70 S6激酶抗体Cell Signaling9206
抗Smad2/3抗体Cell Signaling3102 s
抗磷酸化Smad3抗体Cell Signaling9520 s
抗肌生成抑制素抗体Santa Cruz Biotechnologysc-134345
抗MYOD抗体Santa Cruz Biotechnologysc-760
抗肌球蛋白重链2抗体Biosynthesis Biotechnologybs-10903R
抗肌细胞生成素抗体Biosynthesis Biotechnologybs-3550R
抗β-微管蛋白抗体Biosynthesis Biotechnologybsm-33034M
山羊抗兔二抗LI-COR Biosciences926-32211
抗小鼠二抗LI-COR Biosciences926-68070
GraphPad Prism 9----

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
动物处理
维生素A注射剂量(7500 IU)、频率(每周1次共4次)、对照组(玉米油)、样本量(每组8只)
阅读提示:Materials and methods, 2.2 Animal treatments and diets
组织学分析
肌纤维直径测量方法(H&E染色,每样本≥200个肌纤维,至少3次重复)
阅读提示:Materials and methods, 2.4 H&E staining and diameter measurement
免疫组化
PAX7抗体(RRID: AB_528428)
阅读提示:Materials and methods, 2.5 Immunohistochemical staining
细胞培养
细胞分离方法(胶原酶消化、细胞筛过滤)、培养基(含20% FBS的DMEM)、分化条件(2%马血清,3天和6天)
阅读提示:Materials and methods, 2.6 and 2.7
基因表达分析
qRT-PCR条件(引物序列见表3,内参β-actin,2-△△Ct方法)
阅读提示:Materials and methods, 2.8 Quantitative real-time PCR
蛋白质分析
Western blot条件(一抗和二抗信息)
阅读提示:Materials and methods, 2.9 Western blotting