单细胞转录组测序及差异分析
识别肺腺癌从原发到转移过程中关键的转移相关基因和表达变化。
对1例LUAD患者的168个单细胞（PTT、PTP、MTT、MTP、CTC）进行Smart-seq2测序，经质控后124个细胞用于分析；进一步扩展到8例患者共619个细胞。通过PCA、t-SNE、差异表达基因分析、功能富集和拟时序分析，鉴定RAC1在转移细胞中高表达。
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利用单细胞转录组测序鉴定RAC1在肺腺癌脑转移中的促进作用
Identification of RAC1 in promoting brain metastasis of lung adenocarcinoma using single-cell transcriptome sequencing.
实验完整度
高包含单细胞转录组测序、患者组织IHC、TCGA/HPA数据库生存分析、细胞功能实验（CCK-8、流式、Transwell、划痕、phalloidin染色）及裸鼠体内模型（MRI、HE）等多个独立证据层级，并含功能验证和机制探索。
主要模型
肺腺癌患者原发肿瘤组织、转移肿瘤组织及循环肿瘤细胞 A549和H1975肺癌细胞系 RAC1过表达H1975细胞皮下移植的裸鼠模型 患者组织样本
重点核对
单细胞样本来源：1例患者（PT1）含PTT、PTP、MTT、MTP和CTC，共124个细胞通过质控；扩展7例患者共452个癌细胞（272转移，180原发） RAC1过表达H1975细胞构建：使用慢病毒质粒FV115，转染试剂HilyMAX，筛选浓度200μg/ml G418，qPCR验证过表达效率 RAC1激动剂处理：CN02-A，0.5 units/ml；RAC1抑制剂处理：1177865-17-6，50μM，孵育48小时 动物模型：6周龄雄性Balb/c-nu裸鼠，皮下注射2×10^6细胞（100μl无血清RPMI-1640），观察6周 统计方法：未配对Student's t检验，P<0.05显著；脑转移率比较使用卡方检验（P=0.057）
摘要
本研究旨在为肺腺癌脑转移的生物标志物、涉及的信号通路及潜在治疗策略提供新的视角。我们采用scRNA-seq技术对一名肺腺癌患者的循环肿瘤细胞、原发肿瘤组织和转移肿瘤组织进行了全面的单细胞水平转录组分析，以鉴定转移相关的生物标志物。进一步对7名患者的单细胞进行scRNA-seq，以验证癌症转移特征。还进行了病理学和功能学研究，以证明RAC1在肺腺癌转移中的关键作用。基于免疫组织化学染色、细胞学实验、癌症基因组图谱的生存信息以及人类蛋白质图谱数据库的染色结果，验证了标志基因。PCA分析显示，CTCs处于转移组和原发组之间的中间位置。在无监督聚类分析中，CTCs更接近转移性肿瘤细胞之一，提示转移性肿瘤的异质性以及CTCs起源于转移部位。过渡期相关基因分析鉴定出RAC1在转移性肿瘤组织偏好的基因集中富集，其功能涉及调节性细胞死亡和凋亡以及促进大分子组织。与正常组织相比，基于HPA数据库，LUAD组织中RAC1的表达水平显著升高。RAC1的高表达预示着较差的预后和更高的风险。EMT分析确定了原发细胞倾向于间充质状态，而转移部位的上皮信号更高。功能聚类和通路分析提示，RAC1高表达细胞中的基因在粘附、ECM和VEGF信号通路中发挥关键作用。抑制RAC1可减弱肺癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力。此外，通过MRI T2WI结果，我们证明了RAC1在过表达RAC1的H1975细胞负荷裸鼠模型中可促进脑转移。RAC1及其机制可能促进针对LUAD脑转移的药物设计。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 肺腺癌脑转移的关键分子标志物及其机制是什么？
- 核心机制
- RAC1在转移性肿瘤细胞中高表达，通过促进细胞增殖、抑制凋亡、加速细胞周期（G0/G1向S期转换）以及增强细胞侵袭和迁移能力，促进肺腺癌脑转移。
- 主要证据
- 单细胞测序显示RAC1在转移细胞中富集；IHC和HPA数据库证实RAC1在LUAD及转移灶中高表达；TCGA生存分析显示高RAC1预后更差；细胞实验表明RAC1抑制剂减少增殖、诱导凋亡、抑制侵袭迁移；裸鼠实验显示RAC1过表达组出现脑转移。
- 研究意义
- RAC1及其机制可能为肺腺癌脑转移的药物设计提供新的靶点，有助于改善转移性肺癌的治疗。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
病理学验证与生存分析
验证RAC1在蛋白水平上的表达差异及其与预后的关系。
使用HPA数据库比较正常肺组织与LUAD组织的RAC1表达（IOD）；对6例患者的原发和转移配对组织进行IHC染色；使用TCGA数据库（Oncolnc工具）进行RAC1高低表达的生存分析。
细胞功能实验验证RAC1功能
验证RAC1对肺癌细胞增殖、凋亡、细胞周期、侵袭和迁移的影响。
使用A549和H1975细胞系，通过RAC1激动剂（CN02-A）和抑制剂（1177865-17-6）处理，进行CCK-8增殖实验、AnnexinV-PI凋亡分析、细胞周期分析、Transwell侵袭实验、划痕愈合实验和phalloidin染色检测F-actin表达。
体内实验验证RAC1促进脑转移
验证RAC1过表达在体内是否促进肺腺癌脑转移。
构建RAC1过表达的H1975细胞（慢病毒转染），皮下注射至裸鼠，6周后通过MRI T2WI检测脑转移，并进行HE、Pan-CK染色和RT-PCR验证脑组织中RAC1及周期相关基因表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 组织消化 | 胶原酶P | Roche | -- |
| 胶原酶D | Roche | -- | |
| 脱氧核糖核酸酶I | Roche | -- | |
| M199培养基 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| CFSE | -- | -- | |
| CTC分离 | CD15磁珠 | Invitrogen | -- |
| CD45磁珠 | Invitrogen | -- | |
| CD45-Alexa Fluor 594 | Biolegend | -- | |
| EpCAM抗体（CD326-Alexa Fluor 488） | Biolegend | -- | |
| 单细胞测序 | Smartscribe逆转录酶 | Takara | -- |
| HiFi-HotStart ReadyMix | KAPA Biosystems | -- | |
| Nextera XT文库制备试剂盒 | Illumina | -- | |
| HiSeq 2500测序仪 | Illumina | -- | |
| 免疫组化 | RAC1抗体 | Affinity | AF4200 |
| 细胞培养 | A549细胞系 | CinoAsia Co., Ltd. | -- |
| H1975细胞系 | CinoAsia Co., Ltd. | -- | |
| 药物处理 | RAC1激动剂 | Cytoskeleton | CN02-A |
| RAC1抑制剂 | Topscience | 1177865-17-6 | |
| 凋亡分析 | Annexin V-FITC | BD | -- |
| 碘化丙啶 | -- | -- | |
| 流式分析 | CytoFlex流式细胞仪 | Beckman | -- |
| 细胞周期分析 | 碘化丙啶溶液 | -- | -- |
| 蛋白表达检测 | CDK4抗体 | Affinity | DF6102 |
| CDK6抗体 | Affinity | DF6448 | |
| CyclinD1抗体 | Affinity | AF0931 | |
| 鬼笔环肽染色 | 鬼笔环肽 | Servicebio | G1041-50UL |
| 增殖检测 | CCK-8试剂盒 | -- | -- |
| 酶标仪 | BioTek | uQuant | |
| 侵袭实验 | Matrigel基质胶 | -- | -- |
| 结晶紫 | -- | -- | |
| RAC1过表达构建 | 慢病毒质粒FV115 | GeneralL Biol | -- |
| HilyMAX转染试剂 | Dojindo | -- | |
| G418 | -- | -- | |
| 动物实验 | RPMI-1640培养基 | -- | -- |
| MRI系统（uMR790 3.0T） | United-imaging | -- | |
| 组织学染色 | 伊红溶液 | -- | -- |
| Pan-CK抗体 | Bioss | bs-1712R |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 单细胞测序样本处理 | 组织消化酶浓度和时间：每1ml M199培养基含2mg/ml胶原酶P、2.5mg/ml胶原酶D和10U/μl DNase I，37°C消化60分钟 阅读提示：见Materials and methods中'Solid tumor decomposition and single-cell isolation' |
| CTC分离 | 血液样本量：7.5ml外周血；红细胞裂解液体积：30ml；免疫磁珠：抗WBC磁珠（CD15和CD45） 阅读提示：见Materials and methods中'CTC Isolation' |
| 细胞功能实验 | RAC1激动剂（CN02-A）浓度：0.5 units/ml；RAC1抑制剂（1177865-17-6）浓度：50μM；处理时间：48小时 阅读提示：见Materials and methods中'Cell lines and reagent for functional assay' |
| 凋亡分析 | Annexin V-FITC和PI各5μl，100μl细胞悬液，室温避光孵育20分钟；流式检测至少2×10^4细胞 阅读提示：见Materials and methods中'Apoptosis analyses' |
| 细胞周期分析 | PI溶液浓度500μg/ml，RNaseA 100μg/ml，孵育30分钟 阅读提示：见Materials and methods中'Cell cycle analyses' |
| Transwell侵袭实验 | 上室铺Matrigel，细胞接种12小时，下室含500μl完全培养基 阅读提示：见Materials and methods中'Transwell assay' |
| 划痕愈合实验 | 细胞达到90%融合后划痕，0和24小时拍照；使用Image J软件计算伤口距离 阅读提示：见Materials and methods中'Wound-healing assay' |
| RAC1过表达构建 | 慢病毒质粒FV115（含RAC1 CDS）转染H1975细胞（1×10^6/孔），HilyMAX试剂，筛选浓度200μg/ml G418 阅读提示：见Materials and methods中'Construction of RAC1 overexpressing H1975' |
| 动物模型 | 裸鼠：6周龄雄性Balb/c-nu；每组数量：Blank 3只，NC 5只，RAC1-OE 5只；细胞接种：2×10^6细胞（100μl无血清RPMI-1640）皮下注射右腋窝；观察6周 阅读提示：见Materials and methods中'Nude mice subcutaneous tumor model and magnetic resonance imaging (MRI) observation of brain metastasis' |
| 统计方法 | 组间比较使用未配对Student's t检验；P<0.05为显著；脑转移率比较使用卡方检验 阅读提示：见Materials and methods中'Statistical methods' |