检测FGF1在甲状腺癌组织和细胞中的表达
验证FGF1在甲状腺癌中是否异常表达及其与临床病理特征的关系。
采用RT-qPCR和Western blot检测PTC组织及多种TC细胞系中FGF1 mRNA和蛋白水平，并与正常组织及正常甲状腺细胞比较；采用免疫组织化学检测PTC和ATC组织中FGF1的表达定位。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
细胞内FGF1通过HMGA1不依赖FGF受体促进甲状腺癌的侵袭和迁移
Intracellular FGF1 promotes invasion and migration in thyroid carcinoma via HMGA1 independent of FGF receptors.
实验完整度
高包含临床组织样本检测、细胞系功能实验、EMT标志物检测、受体非依赖验证、HMGA1调控及回补实验等多层级验证。
主要模型
人甲状腺乳头状癌细胞系B-CPAP 人甲状腺未分化癌细胞系CAL-62 人甲状腺癌组织样本 人正常甲状腺滤泡上皮细胞系Nthy-ori 3-1
重点核对
FGF1在PTC组织中的表达水平（n=38，FC=2.4） PTC组织淋巴结转移状态分组（LM(+) n=27, LM(-) n=11） FGF1过表达（LV-FGF1）和敲低（LV-FGF1 shRNA） HMGA1过表达（质粒）和敲低（LV-HMGA1 shRNA） FGFR1抑制剂SU5402和FGFR4抑制剂H3B-6527处理
摘要
背景：成纤维细胞生长因子1（FGF1）在许多肿瘤中广泛扩增，并加速肿瘤的侵袭和转移。然而，FGF1参与甲状腺癌（TC）的作用和精确分子机制仍不清楚。方法：采用实时定量聚合酶链反应和蛋白质印迹法检测TC组织和细胞系中FGF1、高迁移率族蛋白A（HMGA1）、上皮间质转化（EMT）相关因子及FGFs的mRNA和蛋白水平。采用免疫组织化学检测FGF1和HMGA1的表达。采用免疫荧光染色检测FGF1和HMGA1的共表达。采用Transwell和伤口愈合实验评估FGF1对细胞侵袭和迁移能力的影响。结果：FGF1在甲状腺乳头状癌（PTC）组织和细胞系中表达上调，且在伴有宫颈淋巴结转移的PTC组织中相对较高。此外，FGF1通过EMT通路促进侵袭和转移。机制上，FGF1通过不依赖FGF受体的细胞内功能促进EMT。有趣的是，我们证明FGF1可以上调TC细胞中HMGA1的表达，且FGF1与HMGA1在PTC组织中的表达呈正相关。FGF1和HMGA1在细胞核中有明显的共定位。我们进一步揭示FGF1通过上调HMGA1促进TC细胞的侵袭和迁移。结论：细胞内FGF1可通过介导HMGA1的表达，不依赖FGF受体，促进TC的侵袭和迁移，FGF1可能成为TC的有效治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- FGF1在甲状腺癌中是否促进侵袭和迁移，其分子机制是否依赖FGF受体及是否通过HMGA1发挥作用？
- 核心机制
- 细胞内FGF1不依赖FGF受体，通过上调HMGA1表达，激活上皮间质转化（EMT）通路，从而促进甲状腺癌细胞的侵袭和迁移。
- 主要证据
- 临床PTC组织中FGF1和HMGA1表达上调且相关；B-CPAP和CAL-62细胞中FGF1过表达增强迁移侵袭并改变EMT标志物（E-cadherin降低，Vimentin和Slug升高），而敲低则相反；FGFR抑制剂不影响FGF1的作用；HMGA1敲低可逆转FGF1过表达的效果，HMGA1过表达可部分挽救FGF1敲低的抑制效果。
- 研究意义
- 作者提出FGF1可能成为甲状腺癌的有效药物反应指标和潜在治疗靶点，抑制FGF1表达可能阻止疾病进展。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估FGF1对甲状腺癌细胞迁移和侵袭的影响
检测FGF1过表达或敲低是否影响甲状腺癌细胞的迁移和侵袭能力。
在B-CPAP和CAL-62细胞中分别感染LV-FGF1（FGF1 OE）和LV-FGF1 shRNA（FGF1 KD），通过伤口愈合和Transwell实验检测迁移和侵袭能力。
检测FGF1对EMT标志物的影响
验证FGF1是否通过调节EMT相关蛋白促进细胞侵袭迁移。
通过Western blot检测FGF1 OE和KD后B-CPAP和CAL-62细胞中E-cadherin、Vimentin和Slug的蛋白水平。
验证FGF1作用是否依赖FGF受体
探究FGF1促进EMT的作用是否需要FGF受体。
检测PTC组织中FGFR1-4 mRNA水平及FGF1 OE后FGFR1-4 mRNA和蛋白水平；使用FGFR1抑制剂SU5402和FGFR4抑制剂H3B-6527处理，观察对FGF1诱导的EMT相关蛋白的影响。
研究FGF1对HMGA1表达的调控
探究FGF1是否上调HMGA1并与其共定位。
Western blot检测FGF1 OE和KD后HMGA1蛋白水平；免疫荧光检测FGF1和HMGA1在PTC组织和细胞中的共定位；RT-qPCR检测PTC组织中FGF1和HMGA1 mRNA相关性；免疫组化检测PTC和ATC组织中HMGA1表达。
通过回补实验验证FGF1-HMGA1轴
验证HMGA1是否为FGF1促进侵袭迁移和EMT所必需。
在B-CPAP和CAL-62细胞中进行回补实验：FGF1 OE联合HMGA1 KD，以及FGF1 KD联合HMGA1 OE，通过伤口愈合和Transwell实验检测迁移侵袭能力，并用Western blot检测EMT标志物。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Gibco | -- |
| DMEM培养基 | Gibco | -- | |
| 胎牛血清 | HyClone | -- | |
| 非必需氨基酸 | Gibco | -- | |
| 细胞感染和转染 | FGF1慢病毒短发夹RNA | Genechem | -- |
| HMGA1慢病毒短发夹RNA | Genechem | -- | |
| FGF1慢病毒过表达载体 | Genechem | -- | |
| HMGA1质粒 | -- | -- | |
| Lipofectamine 2000转染试剂 | Life Technologies | -- | |
| RNA提取和RT-PCR | TRIzol试剂 | CWBIO | -- |
| RevertAid第一链cDNA合成试剂盒 | Fermentas | -- | |
| RT-PCR | TB Green Premix Ex Taq II | Takara | -- |
| ABI-7500实时PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| Western blotting | RIPA裂解液 | -- | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | CWBIO | -- | |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| 兔抗FGF1抗体 | Abcam | WH168080 | |
| 小鼠抗HMGA1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | SC-393213 | |
| 小鼠抗FGFR1抗体 | Proteintech | 60325-1-lg | |
| 兔抗FGFR4抗体 | Proteintech | 11098-1-AP | |
| 兔抗磷酸化FGFR1 (Y653/Y654)抗体 | Abclonal | AP1317 | |
| 兔抗磷酸化FGFR2 (Tyr463/Tyr466)抗体 | Bioss | bs-5362R | |
| 兔抗磷酸化FGFR3 (Y724)抗体 | Abclonal | AP1274 | |
| 兔抗磷酸化FGFR4 (Y642)抗体 | Cusabio | CSB-PA008250 | |
| 小鼠抗E-钙黏蛋白抗体 | BD Biosciences | 610182 | |
| 兔抗波形蛋白抗体 | Cell Signaling | 10366-1-AP | |
| 小鼠抗β-肌动蛋白抗体 | ORIGENE | TAB11000 | |
| 兔抗Slug抗体 | Proteintech | 12129-1-AP | |
| 辣根过氧化物酶标记的驴抗兔抗体 | Millipore | -- | |
| 辣根过氧化物酶标记的驴抗小鼠抗体 | CWBIO | -- | |
| 免疫荧光染色 | Alexa 488标记的驴抗小鼠二抗 | Invitrogen | -- |
| Cy3标记的驴抗兔二抗 | Invitrogen | -- | |
| Hoechst染料 | Beyotime | -- | |
| Transwell实验 | Transwell小室 | Corning Costar | 8 |
| 统计分析 | GraphPad Prism软件 | GraphPad Prism Software | -- |
| 细胞处理 | SU5402（FGFR1抑制剂） | -- | -- |
| H3B-6527（FGFR4抑制剂） | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 临床样本收集 | 患者纳入排除标准、样本数量（n=38）、淋巴结转移状态分组（LM(+)和LM(-)）、TNM分期 阅读提示：Materials and methods - Tissues of patients |
| 细胞系和培养条件 | 细胞系来源和培养基（RPMI-1640或DMEM）、胎牛血清浓度、培养条件（37°C，5% CO2） 阅读提示：Materials and methods - Cell lines |
| 基因操作 | FGF1和HMGA1的敲低及过表达方法（慢病毒或质粒转染）、对照（shRNA-NC）、转染试剂 阅读提示：Materials and methods - Cell infection and transfection |
| RT-qPCR条件 | RNA提取方法、逆转录试剂盒、PCR循环条件、内参基因、引物序列 阅读提示：Materials and methods - RNA isolation and real-time PCR及Table 1 |
| Western blot条件 | 蛋白提取试剂、抗体稀释比例、孵育条件、显色系统 阅读提示：Materials and methods - Western blotting |
| FGFR抑制剂处理 | SU5402和H3B-6527的使用浓度、处理时间及其对EMT和HMGA1表达的影响 阅读提示：Results - FGF1 promotes EMT...及Figure 3和Figure 4 |
| 功能实验 | 伤口愈合实验划痕时间点（0,24,48小时）、Transwell实验孵育时间（24小时）、细胞数量、基质胶是否使用 阅读提示：Materials and methods - Transwell assay及Wound healing assay |