转录组分析鉴定宿主因子
筛选PEDV感染后上调的宿主基因，特别是线粒体相关基因。
用PEDV（MOI=1）感染IPEC-J2细胞，20hpi后提取RNA进行转录组测序，分析差异表达基因和线粒体相关基因。
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CMPK2是一种以细胞内在方式抑制多种冠状病毒感染的宿主限制因子
CMPK2 is a host restriction factor that inhibits infection of multiple coronaviruses in a cell-intrinsic manner.
实验完整度
高包含转录组分析、体外细胞感染、基因敲除/过表达、启动子报告、ChIP、LC-MS、RdRp活性检测和动物实验等多种独立证据。
主要模型
IPEC-J2细胞 Vero细胞 7日龄仔猪 HEK293T细胞
重点核对
PEDV感染剂量MOI=1及感染时间20hpi CMPK2过表达或敲除对PEDV复制的影响 ddhCTP的LC-MS检测 外源NTP补充对RdRp活性的恢复 CMPK2突变体（ΔAKD、D330A）的功能分析
摘要
冠状病毒（CoVs）是一组重要的人类和动物病原体。尽管在过去3年中进行了广泛的研究，但针对CoVs的宿主先天免疫防御机制仍不完全清楚，这限制了有效抗病毒药物和非抗体疗法的开发。在这里，我们对感染猪流行性腹泻病毒（PEDV）的猪空肠上皮细胞进行了整合转录组分析，并确定了胞苷/尿苷单磷酸激酶2（CMPK2）是一个潜在的宿主限制因子。CMPK2在多种细胞类型中对PEDV感染表现出适度的抗病毒活性。在PEDV感染后，CMPK2的转录受干扰素依赖和干扰素调节因子1（IRF1）依赖途径的调控。我们证明了Viperin（另一种干扰素刺激蛋白）催化的3′-脱氧-3′,4′-二脱氢-胞苷三磷酸（ddhCTP）对CMPK2的抗病毒活性至关重要。CMPK2的经典催化结构域和新鉴定的抗病毒关键结构域在该过程中都发挥了关键作用。总之，CMPK2、viperin和ddhCTP通过抑制RNA依赖性RNA聚合酶活性抑制了其他几种不同属的CoVs的复制。我们的结果揭示了CMPK2作为CoVs限制因子的先前未知功能，暗示CMPK2可能是干扰病毒聚合酶活性的替代靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 宿主因子CMPK2是否及如何抑制冠状病毒复制？
- 核心机制
- CMPK2在PEDV感染后由IRF1直接诱导表达，部分独立于I型干扰素途径，通过其催化活性产生CTP，供Viperin合成ddhCTP，后者作为链终止剂抑制病毒RdRp活性。
- 主要证据
- 转录组和qRT-PCR显示CMPK2上调；过表达和敲除/敲除实验证明抑制PEDV复制；LC-MS检测ddhCTP水平；RdRp活性报告系统显示抑制IBV、PDCoV和SARS-CoV-2 RdRp活性。
- 研究意义
- 揭示CMPK2作为宿主限制因子的新功能，为开发广谱抗冠状病毒药物提供潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证CMPK2表达上调
确认CMPK2在体内外对PEDV感染的反应。
通过qRT-PCR和Western blot检测PEDV感染的Vero和IPEC-J2细胞中CMPK2的mRNA和蛋白水平；也检测了PEDV感染的7日龄仔猪小肠组织中的CMPK2转录水平，并建立了PEDV基因组拷贝数标准曲线。
研究CMPK2表达的调控机制
探究PEDV诱导CMPK2表达的信号通路和转录因子。
使用TBK1抑制剂(GSK8612)、STAT1抑制剂(Fludarabine)和JAK1/2抑制剂(Ruxolitinib)处理PEDV感染的IPEC-J2细胞，检测CMPK2表达；构建CMPK2启动子荧光素酶报告质粒，通过截短突变和JASPAR预测结合位点，并过表达候选转录因子筛选调控因子；ChIP实验验证IRF1结合。
验证CMPK2的抗病毒功能
检测CMPK2对PEDV复制的影响。
在Vero和IPEC-J2细胞中过表达CMPK2或通过siRNA/CRISPR-Cas9敲除，然后感染PEDV，检测病毒N蛋白和RNA水平、病毒滴度（TCID50）和免疫荧光。
确定CMPK2作用的病毒复制步骤
判断CMPK2抑制PEDV复制发生在进入前还是进入后。
进行病毒结合和内化实验，并分析不同时间点细胞内病毒RNA水平。
阐明CMPK2抗病毒机制
验证CMPK2是否通过Viperin和ddhCTP发挥作用。
通过siRNA敲低Viperin、构建Viperin敲除和双敲除细胞、回补实验评估CMPK2和Viperin的上下游关系；LC-MS检测ddhCTP水平；外源NTP补充竞争实验。
定位CMPK2的关键功能域
确定CMPK2中对抗病毒活性必需的结构域和氨基酸。
比对不同物种CMPK2序列，预测AKD；构建AKD缺失突变体（ΔAKD）和催化位点突变体（D330A），检测其对PEDV复制和ddhCTP产生的影响。
评估CMPK2对其他冠状病毒的抑制
测试CMPK2对不同属CoV RdRp活性和复制的影响。
构建基于萤火虫荧光素酶和NanoLuc的复制子报告系统检测RdRp活性；在DF-1细胞中感染IBV，LLC-PK1细胞中感染PDCoV，检测病毒复制。对SARS-CoV-2，测试ddhCTP（前药HLB-0532247或ddhC）和JIB-04的抑制。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Invitrogen | -- | |
| 高级DMEM/F12培养基 | -- | -- | |
| M199培养基 | Gibco | -- | |
| 青霉素 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 链霉素 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 两性霉素B | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 胰蛋白酶 | -- | -- | |
| 病毒抑制实验 | GSK8612 | MCE | HY-111941 |
| 氟达拉滨 | MCE | HYB0069 | |
| 鲁索利替尼 | MCE | HY50856 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | -- | |
| Bradford蛋白定量试剂盒 | Bio-Rad | -- | |
| 硝酸纤维素膜 | GE Healthcare | 10600001 | |
| ECL底物 | Thermo Fisher Scientific | 34580 | |
| qRT-PCR | FastPure细胞/组织总RNA提取试剂盒 | Vazyme | RC112 |
| HiScript II Q RT SuperMix反转录试剂盒 | Vazyme | R223-01 | |
| ChamQ通用SYBR qPCR预混液 | Vazyme | Q711-02 | |
| QuantStudio 6 Flex实时荧光定量PCR仪 | ABI | -- | |
| 细胞活力测定 | CCK-8试剂盒 | Beyotime | -- |
| 双荧光素酶报告实验 | 双荧光素酶报告系统 | Promega | E1910 |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| LC-MS | FastPrep-24珠磨仪 | MP | -- |
| Amicon Ultra-0.5超滤管 | Merck | -- | |
| 甲醇 | -- | -- | |
| MassLynx V4.2软件 | Waters | -- | |
| SARS-CoV-2感染 | JIB-04 | -- | -- |
| ddhC前药 | -- | -- | |
| 抗体 | β-肌动蛋白抗体 | Abcam | ab8226 |
| 抗磷酸化TBK1抗体 | Abcam | ab109272 | |
| 抗TBK1抗体 | Abcam | ab227182 | |
| 抗JAK1抗体 | Abcam | ab125051 | |
| 抗JAK2抗体 | Abcam | ab245303 | |
| 抗磷酸化STAT1抗体 | Beyotime | AF5935 | |
| 抗STAT1抗体 | Beyotime | AF0288 | |
| 兔对照IgG | ABclonal | AC005 | |
| 抗IRF1抗体 | ABclonal | A7692 | |
| 羊抗鸡IgG/FITC | Bioss | -- | |
| FITC标记羊抗小鼠IgG(H+L) | BOSTER | BA1101 | |
| 抗Flag抗体 | Proteintech | 80010-1-RR | |
| 抗HA抗体 | Proteintech | 51064-2-AP | |
| NTP补充 | 核苷三磷酸 | Sangon Biotech | R0481 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源和培养条件，包括培养基、血清、抗生素和胰蛋白酶浓度。 阅读提示：详见Materials and methods中的Cell culture部分。 |
| 病毒感染 | 病毒株、感染剂量（MOI）、感染时间、是否添加胰蛋白酶。 阅读提示：详见Materials and methods中的Viruses and virus infection部分及图例。 |
| CMPK2表达调控实验 | 抑制剂浓度和处理时间，启动子报告质粒构建细节，转录因子过表达和siRNA序列。 阅读提示：详见Fig 2、Fig 3图例和Materials and methods中的相关部分。 |
| CMPK2抗病毒功能实验 | 转染时间、感染剂量、检测时间点、siRNA和CRISPR敲除效率。 阅读提示：详见Fig 4图例和Materials and methods。 |
| ddhCTP检测 | 细胞裂解方法、LC-MS条件、定量方法。 阅读提示：详见Materials and methods中的Detection of ddhCTP in cell lysates部分。 |
| RdRp活性实验 | 报告质粒构建、转染条件、NTP浓度、检测时间。 阅读提示：详见Fig 7图例和Materials and methods中的Cell-based virus RdRp activity assay部分。 |