免疫方案建立
评估APS作为佐剂对ISV和RSV免疫应答的影响。
BALB/c小鼠分别用ISV或RSV联合不同剂量APS、铝佐剂或PBS进行肌肉注射免疫，进行初免和加强免疫。
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黄芪多糖作为流感疫苗和重组SARS-CoV-2疫苗佐剂的双向、持久免疫调节作用
Bidirectional and persistent immunomodulation of Astragalus polysaccharide as an adjuvant of influenza and recombinant SARS-CoV-2 vaccine.
实验完整度
高包含体外淋巴细胞增殖实验、体内小鼠免疫模型、流感病毒致死性攻击实验、RNA-seq转录组分析及q-PCR验证，形成多证据层级。
主要模型
BALB/c小鼠模型 流感裂解疫苗免疫模型 重组SARS-CoV-2疫苗免疫模型 流感病毒攻击模型
重点核对
小鼠品系：雌性BALB/c小鼠，6至8周龄 疫苗剂量：ISV含15 μg血凝素/只，RSV含40 μg抗原/只 APS剂量：500、800、1100 μg/只 免疫途径：后腿外侧肌肉注射，每只0.2 mL 病毒攻击：H1N1(A/PR/8/1934)病毒，50 μL/只，滴鼻
摘要
呼吸道病毒感染，如2019冠状病毒病（COVID-19）和流感，导致显著的发病率和死亡率，已成为具有巨大经济和社会负担的全球公共卫生问题。疫苗接种是预防感染的主要策略。然而，尽管疫苗和佐剂研究持续进行，一些新疫苗在某些个体中仍存在免疫应答不足的需求，尤其是COVID-19疫苗。在此，我们评估了黄芪多糖（APS）作为免疫佐剂调节流感裂解疫苗（ISV）和重组严重急性呼吸综合征（SARS）-Cov-2疫苗在小鼠中效果的有效性。我们的数据表明，APS作为佐剂可以促进高水平的血凝抑制（HAI）滴度和特异性抗体免疫球蛋白G（IgG）的诱导，并赋予针对甲型流感病毒致死性攻击的保护，包括提高接受ISV免疫小鼠的存活率和改善体重减轻。RNA测序（RNA-seq）分析揭示，NF-κB和Fc gamma R介导的吞噬信号通路对于接受重组SARS-Cov-2疫苗（RSV）免疫的小鼠的免疫应答至关重要。另一个重要发现是观察到APS对细胞免疫和体液免疫的双向免疫调节作用，并且APS佐剂诱导的抗体持续高水平至少20周。这些发现表明，APS是流感和COVID-19疫苗的有效佐剂，并具有双向免疫调节和持久免疫的优点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 探究黄芪多糖（APS）作为流感裂解疫苗（ISV）和重组SARS-CoV-2疫苗（RSV）佐剂的有效性及其免疫调节机制。
- 核心机制
- APS通过NF-κB和Fc gamma R介导的吞噬信号通路发挥佐剂效应，并具有双向免疫调节作用，即在抗体水平低时增强免疫应答，抗体水平高时抑制过度应答以维持免疫平衡。
- 主要证据
- 小鼠免疫实验显示APS显著提高HAI滴度和特异性IgG抗体，增强淋巴细胞增殖，调节T细胞亚群和细胞因子分泌，并保护小鼠免受流感病毒致死性攻击；RNA-seq和q-PCR验证了NF-κB和Fc gamma R信号通路。
- 研究意义
- 表明APS是流感和COVID-19疫苗的潜在有效佐剂，具有双向免疫调节和持久免疫的优势，可能适用于其他呼吸道相关疫苗。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
抗体应答检测
评估APS佐剂对疫苗诱导的体液免疫应答。
采集血清，通过HAI实验检测H1N1和BY病毒抗体滴度，通过ELISA试剂盒检测特异性IgG抗体。
病毒攻击保护实验
评估APS佐剂增强ISV对致死性流感病毒攻击的保护效果。
免疫后第28天，用H1N1(A/PR/8/1934)病毒滴鼻攻击小鼠，监测体重和存活率14天。
免疫器官和淋巴细胞分析
评估APS佐剂对免疫器官和淋巴细胞功能的影响。
分离胸腺、脾脏和骨髓细胞，测量器官指数，MTT法检测脾淋巴细胞增殖，流式细胞术分析T细胞亚群、细胞因子分泌和DC成熟标志物。
细胞因子和IgG亚型检测
评估APS佐剂对Th1/Th2免疫应答的影响。
采集血清，ELISA检测IL-4、IL-2、IgG1、IgG2a、IFN-γ、TNF-α和MCP-1水平。
转录组机制分析
揭示APS佐剂增强RSV免疫应答的分子机制。
提取胸腺组织RNA，进行RNA-seq，鉴定差异表达基因，并KEGG通路富集分析，用q-PCR验证10个基因的表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫 | Imject™铝佐剂 | Beijing Bioss Biotechnology Co. Ltd. | -- |
| 血清处理 | 受体破坏酶 | Denka Seiken | -- |
| HAI实验 | 鸡红细胞 | Guangzhou Hongquan Biotechnology Co., LTD | -- |
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Invitrogen | -- |
| 胎牛血清 | Beijing Aoqing Biotechnology Co., LTD | -- | |
| 淋巴细胞增殖 | MTT | Solarbio | -- |
| 刀豆蛋白A | Apexbio | -- | |
| 脂多糖 | Sigma | -- | |
| ELISA | IL-4 ELISA试剂盒 | Shanghai Enzyme-linked Biotechnology Co., Ltd. | 20220111-20186A |
| IL-2 ELISA试剂盒 | Shanghai Enzyme-linked Biotechnology Co., Ltd. | 20220111-20176A | |
| IgG1 ELISA试剂盒 | Shanghai Enzyme-linked Biotechnology Co., Ltd. | 20220111-20510A | |
| IgG2a ELISA试剂盒 | Shanghai Enzyme-linked Biotechnology Co., Ltd. | 20220111-20512A | |
| IFN-γ ELISA试剂盒 | Shanghai Enzyme-linked Biotechnology Co., Ltd. | 20220111-20140A | |
| TNF-α ELISA试剂盒 | Shanghai Enzyme-linked Biotechnology Co., Ltd. | 20220111-20852A | |
| MCP-1 ELISA试剂盒 | Shanghai Enzyme-linked Biotechnology Co., Ltd. | 20220111-20248A | |
| 流式分析 | 7-AAD | -- | -- |
| FITC标记抗小鼠CD3抗体 | BioLegend, Inc., USA | -- | |
| APC标记抗小鼠CD4抗体 | BioLegend, Inc., USA | -- | |
| PE标记抗小鼠CD8a抗体 | BioLegend, Inc., USA | -- | |
| SARS-CoV-2刺突蛋白肽库 | Sino Biological, Inc., China | -- | |
| BV421标记抗小鼠IFN-γ抗体 | Sino Biological, Inc., China | -- | |
| BV605标记大鼠抗小鼠IL-2抗体 | Sino Biological, Inc., China | -- | |
| PE-CF594标记大鼠抗小鼠IL-4抗体 | Sino Biological, Inc., China | -- | |
| PE-Cy7标记抗小鼠TNF-α抗体 | Sino Biological, Inc., China | -- | |
| FITC标记抗小鼠MHC II类抗体 | Thermo Fisher Technology (China) Co., LTD | -- | |
| BV421标记仓鼠抗小鼠CD80抗体 | BioLegend, Inc., USA | -- | |
| PE标记大鼠抗小鼠CD86抗体 | BioLegend, Inc., USA | -- | |
| BV786标记仓鼠抗小鼠CD11c抗体 | BioLegend, Inc., USA | -- | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| RNA处理 | 无RNase的DNase I | Takara | -- |
| RNA-seq文库构建 | NEBNext® Ultra™ RNA文库制备试剂盒 | NEB | -- |
| RNA-seq | Illumina Novaseq 6000测序仪 | Illumina | -- |
| q-PCR | Goldenstar RT6 cDNA合成试剂盒 | -- | -- |
| Fast qPCR Mix (SYBR Green I) | -- | -- | |
| 统计分析 | SPSS软件 | IBM | -- |
| GraphPad Prism 7.0 | GraphPad Software | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 免疫方案 | 小鼠品系、性别、周龄：雌性BALB/c小鼠，6至8周龄；分组：每组5只（ISV）或6只（RSV）；疫苗剂量：ISV 15 μg血凝素/只，RSV 40 μg抗原/只；佐剂剂量：APS 500、800、1100 μg/只，铝佐剂100 μg/只；免疫途径：肌肉注射，0.2 mL/只；免疫次数：ISV两次（0、14天），RSV三次（0、4、11周）。 阅读提示：Materials and methods 2.4.1 和 2.4.2 |
| 病毒攻击 | 病毒株：H1N1(A/PR/8/1934)；攻击途径：滴鼻，50 μL/只；攻击时间：初免-加强免疫后28天；监测指标：体重和存活率，体重减轻>30%视为死亡。 阅读提示：Materials and methods 2.4.1 |
| 抗体检测 | HAI实验：血清需RDE处理（37°C 16小时，56°C 1小时），病毒用量：4个HA单位；IgG检测：使用商品化试剂盒，按说明书操作。 阅读提示：Materials and methods 2.5 和 2.6 |
| 淋巴细胞增殖 | 脾细胞浓度：1×10^6 cells/mL；刺激剂：ConA（5 μg/mL）和LPS（1 μg/mL）；培养条件：37°C，48小时；检测方法：MTT法。 阅读提示：Materials and methods 2.7 |
| 流式分析 | 脾细胞浓度：1×10^6 cells/mL；抗体组合：CD3、CD4、CD8a；RSV组需用S蛋白肽库刺激4小时；骨髓DC分析：MHC II、CD80、CD86、CD11c。 阅读提示：Materials and methods 2.9 和 2.10 |
| RNA-seq | 组织：胸腺；RNA提取方法：TRIzol；文库构建试剂盒：NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit；测序平台：Illumina Novaseq 6000；差异基因筛选阈值：adjusted P < 0.05；q-PCR验证基因列表。 阅读提示：Materials and methods 2.11 |