人肥大细胞RvD1释放检测
验证人肥大细胞在IgE介导的活化后是否释放RvD1。
使用CBMCs、LAD-2、FSMCs和NPMCs,经DHA预孵育后,用抗IgE活化,30分钟或1小时后收集上清检测RvD1。
Mast cells contribute to the resolution of allergic inflammation by releasing resolvin D1.
包含体外细胞实验(多种人源和鼠源肥大细胞)、共培养实验、体内小鼠过敏性腹膜炎模型,并检测RvD1释放、15-LO表达及炎症细胞浸润,具有功能和机制验证。
人脐带血来源肥大细胞(CBMCs) LAD-2肥大细胞系 包皮来源肥大细胞(FSMCs) 鼻息肉来源肥大细胞(NPMCs) 小鼠骨髓来源肥大细胞(BMMCs) 卵清蛋白/金黄色葡萄球菌肠毒素B诱导的小鼠过敏性腹膜炎模型
在体外实验中,肥大细胞用20 μM二十二碳六烯酸(DHA)预孵育30分钟,然后进行IgE介导的活化。 人肥大细胞活化使用5 μg/ml小鼠抗人IgE抗体。 人外周血嗜酸性粒细胞用50 ng/ml GM-CSF priming后用10^-6 M PAF活化。 体内实验中,小鼠在第0天腹腔注射10 μg OVA和0.1 μg SEB进行激发。 体内实验中,在激发后3天腹腔注射2 x 10^6 BMMCs。
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证人肥大细胞在IgE介导的活化后是否释放RvD1。
使用CBMCs、LAD-2、FSMCs和NPMCs,经DHA预孵育后,用抗IgE活化,30分钟或1小时后收集上清检测RvD1。
确定肥大细胞活化后15-LO表达是否改变,以及5-LO表达的影响。
通过RT-PCR和流式细胞术检测活化后不同时间点(30min、1h、2h、24h)LAD-2、CBMCs、FSMCs中Alox15和Alox5的表达。
探究肥大细胞与嗜酸性粒细胞共培养是否改变RvD1产生。
将CBMCs与外周血Eos共培养,IgE活化30分钟后检测RvD1释放、15-LO表达、类胰蛋白酶释放和EPX释放。
验证小鼠肥大细胞是否类似地释放RvD1以及15-LO表达变化。
培养小鼠BMMCs,用IgE/DNP-BSA活化,1小时后检测RvD1释放、Alox15表达和类胰蛋白酶释放。
评估在过敏性腹膜炎中,肥大细胞超量是否影响炎症消退和RvD1水平。
WT小鼠用OVA/SEB致敏和激发,在激发后3天腹腔注射BMMCs,在不同时间点(1h、2天、6天)收集腹膜灌洗液检测细胞数、炎症细胞亚群、类胰蛋白酶和RvD1水平。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞分离 | Ficoll-Paque | -- | -- |
| 细胞培养 | 干细胞因子 | Amgen | -- |
| RPMI-1640培养基 | -- | -- | |
| 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 | Peprotech | -- | |
| 细胞活化 | 人骨髓瘤IgE | Calbiochem | -- |
| 小鼠抗人IgE抗体 | Dako | -- | |
| 二十二碳六烯酸 | Cayman Chemical | -- | |
| ELISA | RvD1 ELISA试剂盒 | Cayman Chemical | -- |
| RT-PCR | Quick-RNA小提试剂盒 | ZymoResearch | -- |
| qScript cDNA合成试剂盒 | Quantabio | -- | |
| Nanodrop ND-1000分光光度计 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| BioRad Chemidoc XRS凝胶成像系统 | BioRad | -- | |
| 流式细胞术 | APC抗人15-LO抗体 | Bioss Antibodies Inc. | bs-6505R |
| FITC抗人FcεRIα抗体 | BioLegend | 334607 | |
| PE抗人CCR3抗体 | R&D biosystems | FAB155P | |
| APC大鼠抗小鼠CD117抗体 | BioLegend | 105812 | |
| PE大鼠抗小鼠FcεRIα抗体 | BioLegend | 134307 | |
| PE大鼠抗小鼠Siglec-F抗体 | BD biosciences | 562068 | |
| APC抗小鼠CCR3抗体 | BioLegend | 144511 | |
| BD LSR II流式细胞仪 | BD Bioscience | -- | |
| 体内实验 | 卵清蛋白 | Sigma-Aldrich | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 体外肥大细胞活化 | 细胞类型、DHA预孵育浓度和时间、IgE抗体浓度、活化时间。 阅读提示:Methods 中的“Cell treatment and activation”部分 |
| 共培养实验 | 细胞比例、活化条件、培养时间。 阅读提示:Results 中“MC-Eos co-culture”部分及图3图例 |
| 体内过敏性腹膜炎模型 | 小鼠品系、致敏和激发方案、BMMC注射数量和时机、观察时间点。 阅读提示:Methods 中的“Allergic peritonitis model”部分和图5、图6图例 |