数据获取与处理
获取结直肠癌(CRC)的转录组数据和临床信息,用于后续分析。
从TCGA下载556例CRC样本的RNA-seq数据(FPKM格式)和相应临床信息;从GEO下载GSE17536验证数据集。
SPOCK1 and POSTN are valuable prognostic biomarkers and correlate with tumor immune infiltrates in colorectal cancer.
该研究为基于公共数据库(TCGA、GEO)的生物信息学分析,并辅以少量临床样本(8对)的免疫组化和免疫荧光验证,缺乏体内外功能实验和机制验证。
结直肠癌组织及癌旁组织(8对临床样本) TCGA结直肠癌数据集(511例具有完整临床信息的样本) GEO GSE17536数据集(177例结直肠癌样本)
TCGA样本量:556例用于表达分析,511例用于生存和临床相关性分析 GSE17536数据集样本量:177例,用于验证预后 临床样本:8对结肠癌及对应癌旁组织,用于免疫组化和免疫荧光验证 ESTIMATE算法分组:按免疫/基质评分中位数分为高、低分组 DEGs筛选阈值:|log2 FC| ≥ 1.0,FDR < 0.05
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
获取结直肠癌(CRC)的转录组数据和临床信息,用于后续分析。
从TCGA下载556例CRC样本的RNA-seq数据(FPKM格式)和相应临床信息;从GEO下载GSE17536验证数据集。
基于免疫和基质评分鉴定与肿瘤微环境相关的差异表达基因(DEGs)。
使用ESTIMATE算法计算每个CRC样本的免疫和基质评分,按中位数分为高分组和低分组,使用limma包进行差异表达分析。
探索DEGs参与的生物学过程和信号通路。
对1318个DEGs进行GO和KEGG富集分析。
识别与临床特征显著相关的基因模块。
利用1318个DEGs的表达谱和511个样本的临床数据,使用WGCNA构建共表达网络,鉴定显著模块。
筛选与生存相关的关键基因。
对DEGs进行单因素Cox回归分析,与WGCNA的hub基因取交集,得到SPOCK1和POSTN;使用GEPIA和GSE17536进行生存分析验证。
确定SPOCK1和POSTN的主要表达细胞类型。
整合GSE110009和GSE120065单细胞转录组数据,使用Seurat包处理,通过t-SNE聚类分析。
探索SPOCK1和POSTN高/低表达组中富集的KEGG通路。
根据SPOCK1和POSTN表达中位数将TCGA样本分为高低组,进行基因集富集分析。
评估SPOCK1和POSTN表达与免疫细胞浸润的相关性。
使用CIBERSORT算法估算22种免疫细胞的比例,比较高低表达组的差异;使用TIMER分析六种免疫细胞的相关性。
验证SPOCK1、POSTN和巨噬细胞标志物在结直肠癌组织中的表达。
对8对结直肠癌和癌旁组织进行免疫组化和免疫荧光染色,检测SPOCK1、POSTN、CD68和CD206的表达。
分析SPOCK1和POSTN表达与免疫检查点基因表达的相关性。
基于TCGA数据,使用Spearman相关分析评估SPOCK1和POSTN与PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM-3和B7-H3的相关性。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫组化 | 抗SPOCK1抗体 | Abcam | ab229935 |
| 抗POSTN抗体 | Bioss | bs-4994R | |
| 抗CD68抗体 | Santa | SC-20060 | |
| DAB染色试剂盒 | GeneTech Company, Ltd., Shanghai, China | -- | |
| 免疫荧光 | Cy3标记的山羊抗兔IgG | -- | -- |
| FITC标记的山羊抗小鼠IgG (H+L) | -- | -- | |
| DAPI | -- | -- | |
| 显微镜 | Nikon NIS Elements BR光学显微镜 | Nikon | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 样本收集 | 8对原发肿瘤和对应正常组织,来自武汉大学中南医院;纳入标准:原发病理确诊,未接受术前新辅助放化疗;排除标准:非治愈性切除、复发、重要器官严重损伤、自身免疫病史。 阅读提示:参见Materials and methods中的Specimen collection |
| TCGA数据处理 | 基因表达数据为FPKM格式;556例用于表达分析,511例用于生存和临床相关性分析。 阅读提示:参见Materials and methods中的Data collection and processing |
| ESTIMATE评分 | 使用ESTIMATE算法计算免疫和基质评分;按中位数分为高分组和低分组。 阅读提示:参见Materials and methods中的Differentially expressed genes (DEGs) screening |
| 差异表达分析 | 阈值:|log2 FC| ≥ 1.0,FDR < 0.05。 阅读提示:参见Materials and methods中的Differentially expressed genes (DEGs) screening |
| WGCNA分析 | 软阈值设为9;模块合并阈值MEDissThres为0.25;最小基因模块大小为30。 阅读提示:参见Materials and methods中的Construction of weighted co-expression network and identification of clinical significant modules |
| 关键基因筛选 | 单因素Cox回归p < 0.01;hub基因取模块中连接度前30。 阅读提示:参见Materials and methods中的Key genes screening and validation |
| 生存分析 | GEPIA分析基于TCGA和GTEx数据;GSE17536数据集中验证。 阅读提示:参见Materials and methods中的Key genes screening and validation |
| 单细胞RNA-seq分析 | 数据来源GSE110009和GSE120065;过滤条件:nFeature_RNA < 50,线粒体计数 > 5%的细胞被排除。 阅读提示:参见Materials and methods中的ScRNA-seq data preparation and processing |
| GSEA分析 | 基于SPOCK1和POSTN表达中位数分组;置换次数1000;显著性阈值NOM p < 0.05,FDR q < 0.25。 阅读提示:参见Materials and methods中的Gene set enrichment analysis (GSEA) |
| 免疫浸润分析 | CIBERSORT:p < 0.05的样本纳入分析;TIMER分析6种免疫细胞。 阅读提示:参见Materials and methods中的Correlation analysis between key genes and immune microenvironment |
| 免疫组化和免疫荧光 | 组织固定于4%多聚甲醛中3天;抗体稀释:SPOCK1 1:200,POSTN 1:200,CD68 1:100,CD206 1:100;荧光二抗1:50稀释。 阅读提示:参见Materials and methods中的10 immunohistochemical staining and tissue immunofluorescence staining |
| 统计方法 | R版本3.6.3,SPSS V25.0;生存分析使用Kaplan-Meier和对数秩检验;相关性使用Spearman相关。 阅读提示:参见Materials and methods中的Statistical analysis |