SPOCK1和POSTN是有价值的预后生物标志物,并与结直肠癌中的肿瘤免疫浸润相关

SPOCK1 and POSTN are valuable prognostic biomarkers and correlate with tumor immune infiltrates in colorectal cancer.

作者信息Caiqin Gan, Mengting Li, Yuanyuan Lu, Ganjing Peng, Wenjie Li, Haizhou Wang, Yanan Peng, Qian Hu, Wanhui Wei, Fan Wang, Lan Liu, Qiu Zhao
PMID36611136
发布时间2023-01-07
DOI10.1186/s12876-022-02621-2

实验完整度

该研究为基于公共数据库(TCGA、GEO)的生物信息学分析,并辅以少量临床样本(8对)的免疫组化和免疫荧光验证,缺乏体内外功能实验和机制验证。

主要模型

结直肠癌组织及癌旁组织(8对临床样本) TCGA结直肠癌数据集(511例具有完整临床信息的样本) GEO GSE17536数据集(177例结直肠癌样本)

重点核对

TCGA样本量:556例用于表达分析,511例用于生存和临床相关性分析 GSE17536数据集样本量:177例,用于验证预后 临床样本:8对结肠癌及对应癌旁组织,用于免疫组化和免疫荧光验证 ESTIMATE算法分组:按免疫/基质评分中位数分为高、低分组 DEGs筛选阈值:|log2 FC| ≥ 1.0,FDR < 0.05

摘要

背景:肿瘤微环境中的免疫细胞和基质细胞在结直肠癌(CRC)的进展中发挥重要作用。本研究旨在基于基质和免疫评分筛选CRC中有价值的预后生物标志物。方法:使用ESTIMATE算法计算TCGA中CRC样本的免疫和基质评分。然后根据评分的中位数将样本分为高分组和低分组。筛选与免疫和基质评分相关的差异表达基因(DEGs)。进一步采用WGCNA和单因素COX回归分析来鉴定关键预后基因。对CRC的scRNA-seq分析用于验证关键基因的主要来源。基于基因表达谱交互分析和GSE17536数据集验证了它们的预后价值。应用TIMER和CIBERSORT算法分析关键基因与肿瘤浸润免疫细胞之间的相关性。使用了几对结肠癌组织进行验证。结果:鉴定出1314个上调基因和4个下调基因,这些基因显著富集在免疫相关的生物学过程和通路中。在这些DEGs中,SPOCK1和POSTN被确定为关键预后基因,主要在CRC的癌症相关成纤维细胞中表达。SPOCK1和POSTN的高表达与CRC的晚期临床分期、T分期、N分期和不良预后相关。CIBERSORT和TIMER的结果显示,SPOCK1和POSTN与肿瘤浸润免疫细胞相关,尤其是巨噬细胞和中性粒细胞。同时,在几对结直肠组织样本中,发现SPOCK1和POSTN在结直肠癌组织中显著过表达,而巨噬细胞表面标志物CD68(由M1和M2巨噬细胞共表达)和CD206(M2特异性巨噬细胞表达)也在癌组织中过表达。此外,SPOCK1和POSTN的表达与免疫检查点的表达呈正相关。结论:总之,我们的结果表明与CAF相关的SPOCK1和POSTN可能是CRC的新型预后生物标志物,并与免疫浸润相关。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
基于免疫和基质评分,筛选结直肠癌中有价值的预后生物标志物,并探索其与肿瘤免疫浸润的关系。
核心机制
SPOCK1和POSTN主要在癌症相关成纤维细胞(CAF)中表达,其高表达与M2型巨噬细胞极化、中性粒细胞浸润及免疫检查点表达正相关,可能通过调节免疫微环境促进肿瘤进展和免疫逃逸。
主要证据
TCGA和GEO数据(GEPIA和GSE17536)显示高表达SPOCK1和POSTN与较差的总生存期和无病生存期相关;免疫组化和免疫荧光显示SPOCK1和POSTN在结直肠癌组织中高表达,且与CD68和CD206(巨噬细胞标志物)共表达。
研究意义
SPOCK1和POSTN可能作为结直肠癌的预后生物标志物和免疫治疗的靶点。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

数据获取与处理

获取结直肠癌(CRC)的转录组数据和临床信息,用于后续分析。

从TCGA下载556例CRC样本的RNA-seq数据(FPKM格式)和相应临床信息;从GEO下载GSE17536验证数据集。

2

ESTIMATE评分与差异基因筛选

基于免疫和基质评分鉴定与肿瘤微环境相关的差异表达基因(DEGs)。

使用ESTIMATE算法计算每个CRC样本的免疫和基质评分,按中位数分为高分组和低分组,使用limma包进行差异表达分析。

3

功能富集分析

探索DEGs参与的生物学过程和信号通路。

对1318个DEGs进行GO和KEGG富集分析。

4

WGCNA共表达网络构建

识别与临床特征显著相关的基因模块。

利用1318个DEGs的表达谱和511个样本的临床数据,使用WGCNA构建共表达网络,鉴定显著模块。

5

关键预后基因鉴定与验证

筛选与生存相关的关键基因。

对DEGs进行单因素Cox回归分析,与WGCNA的hub基因取交集,得到SPOCK1和POSTN;使用GEPIA和GSE17536进行生存分析验证。

6

单细胞RNA-seq分析

确定SPOCK1和POSTN的主要表达细胞类型。

整合GSE110009和GSE120065单细胞转录组数据,使用Seurat包处理,通过t-SNE聚类分析。

7

GSEA通路富集分析

探索SPOCK1和POSTN高/低表达组中富集的KEGG通路。

根据SPOCK1和POSTN表达中位数将TCGA样本分为高低组,进行基因集富集分析。

8

免疫浸润相关性分析

评估SPOCK1和POSTN表达与免疫细胞浸润的相关性。

使用CIBERSORT算法估算22种免疫细胞的比例,比较高低表达组的差异;使用TIMER分析六种免疫细胞的相关性。

9

临床样本验证

验证SPOCK1、POSTN和巨噬细胞标志物在结直肠癌组织中的表达。

对8对结直肠癌和癌旁组织进行免疫组化和免疫荧光染色,检测SPOCK1、POSTN、CD68和CD206的表达。

10

免疫检查点相关性分析

分析SPOCK1和POSTN表达与免疫检查点基因表达的相关性。

基于TCGA数据,使用Spearman相关分析评估SPOCK1和POSTN与PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM-3和B7-H3的相关性。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

数据获取与预处理
估计免疫/基质评分
差异表达分析
加权基因共表达网络分析
单细胞数据分析
基因集富集分析
免疫组化
免疫荧光
相关性分析

产品清单

实验环节名称品牌货号
抗SPOCK1抗体Abcamab229935
抗POSTN抗体Biossbs-4994R
抗CD68抗体SantaSC-20060
DAB染色试剂盒GeneTech Company, Ltd., Shanghai, China--
Cy3标记的山羊抗兔IgG----
FITC标记的山羊抗小鼠IgG (H+L)----
DAPI----
Nikon NIS Elements BR光学显微镜Nikon--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
样本收集
8对原发肿瘤和对应正常组织,来自武汉大学中南医院;纳入标准:原发病理确诊,未接受术前新辅助放化疗;排除标准:非治愈性切除、复发、重要器官严重损伤、自身免疫病史。
阅读提示:参见Materials and methods中的Specimen collection
TCGA数据处理
基因表达数据为FPKM格式;556例用于表达分析,511例用于生存和临床相关性分析。
阅读提示:参见Materials and methods中的Data collection and processing
ESTIMATE评分
使用ESTIMATE算法计算免疫和基质评分;按中位数分为高分组和低分组。
阅读提示:参见Materials and methods中的Differentially expressed genes (DEGs) screening
差异表达分析
阈值:|log2 FC| ≥ 1.0,FDR < 0.05。
阅读提示:参见Materials and methods中的Differentially expressed genes (DEGs) screening
WGCNA分析
软阈值设为9;模块合并阈值MEDissThres为0.25;最小基因模块大小为30。
阅读提示:参见Materials and methods中的Construction of weighted co-expression network and identification of clinical significant modules
关键基因筛选
单因素Cox回归p < 0.01;hub基因取模块中连接度前30。
阅读提示:参见Materials and methods中的Key genes screening and validation
生存分析
GEPIA分析基于TCGA和GTEx数据;GSE17536数据集中验证。
阅读提示:参见Materials and methods中的Key genes screening and validation
单细胞RNA-seq分析
数据来源GSE110009和GSE120065;过滤条件:nFeature_RNA < 50,线粒体计数 > 5%的细胞被排除。
阅读提示:参见Materials and methods中的ScRNA-seq data preparation and processing
GSEA分析
基于SPOCK1和POSTN表达中位数分组;置换次数1000;显著性阈值NOM p < 0.05,FDR q < 0.25。
阅读提示:参见Materials and methods中的Gene set enrichment analysis (GSEA)
免疫浸润分析
CIBERSORT:p < 0.05的样本纳入分析;TIMER分析6种免疫细胞。
阅读提示:参见Materials and methods中的Correlation analysis between key genes and immune microenvironment
免疫组化和免疫荧光
组织固定于4%多聚甲醛中3天;抗体稀释:SPOCK1 1:200,POSTN 1:200,CD68 1:100,CD206 1:100;荧光二抗1:50稀释。
阅读提示:参见Materials and methods中的10 immunohistochemical staining and tissue immunofluorescence staining
统计方法
R版本3.6.3,SPSS V25.0;生存分析使用Kaplan-Meier和对数秩检验;相关性使用Spearman相关。
阅读提示:参见Materials and methods中的Statistical analysis