猪模型构建及表型分析
验证UCP1表达是否改变猪的脂肪沉积表型。
使用CRISPR/Cas9技术生成UCP1敲入猪，在CD和HFHC饮食条件下测量脂肪沉积指标。
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UCP1敲入猪通过脂肪-肝脏-肠道轴重塑粪便微生物群并有助于减少脂肪沉积
Fecal Microbiota Was Reshaped in UCP1 Knock-In Pigs via the Adipose-Liver-Gut Axis and Contributed to Less Fat Deposition.
实验完整度
高包含猪模型的多组学分析（16S rRNA测序、代谢组学）、FMT小鼠功能验证、HDCA处理小鼠及3T3-L1细胞实验、HepG2细胞机制研究。
主要模型
UCP1敲入猪 C57BL/6J小鼠（FMT受体） 3T3-L1前脂肪细胞 HepG2细胞
重点核对
UCP1猪与WT猪在不同饮食条件下的粪便菌群组成差异 FMT小鼠中来自UCP1猪的菌群对脂肪沉积的影响 HDCA对小鼠体重和脂肪沉积的影响 PC处理HepG2细胞对胆固醇合成基因表达的影响
摘要
宿主肠道微生物群与肥胖之间的关系已在人类和小鼠中得到充分证实；然而，很少有研究报道猪肠道微生物群与脂肪沉积之间的关联。在之前的一项研究中，我们生成了解偶联蛋白1（UCP1）敲入猪（UCP1猪），其表现出较低的脂肪沉积表型。这些猪的肠道微生物群是否被重塑，以及重塑的肠道微生物群是否有助于降低脂肪含量仍不清楚。在此，我们揭示了与野生型（WT）猪相比，UCP1猪在普通饮食（CD）和高脂/高胆固醇（HFHC）饮食条件下，粪便微生物群组成和代谢物均发生显著改变。在UCP1猪中，Oscillospira和Coprococcus的丰度以及粪便中的代谢物猪去氧胆酸（HDCA）水平显著增加。关联分析显示，Oscillospira和Coprococcus与背膘厚度显著负相关。此外，在粪便微生物群移植（FMT）后，口服灌胃UCP1猪粪便的小鼠在CD和高脂饮食（HFD）条件下均表现出较少的脂肪沉积，表明UCP1猪的粪便微生物参与调节宿主脂质代谢。一致地，HDCA处理的小鼠也表现出降低的脂肪含量。机制上，我们发现白色脂肪组织中UCP1的表达通过脂肪-肝脏-肠道轴改变猪的肠道微生物群。我们的研究提供了关于宿主遗传变异与肠道微生物群之间相互作用的新数据，并为微生物或其代谢物在调节猪脂肪沉积中的潜在应用铺平了道路。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- UCP1在白色脂肪组织中的异位表达是否重塑猪的肠道微生物群，以及重塑的微生物群及其代谢物是否有助于降低脂肪沉积。
- 核心机制
- UCP1表达改变脂肪组织脂质组成，通过循环影响肝脏胆固醇和胆汁酸合成，经胆汁酸改变肠道菌群，其中HDCA通过促进脂肪组织脂解和抑制脂肪生成减少脂肪沉积。
- 主要证据
- 16S rRNA测序显示菌群组成改变；FMT实验复制低脂表型；HDCA处理小鼠降低脂肪；PC处理HepG2细胞降低胆固醇合成基因表达。
- 研究意义
- 提供宿主遗传变异与肠道菌群互作的新数据，为微生物或其代谢物作为饲料添加剂调节猪脂肪沉积的应用奠定基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
粪便微生物群组成分析
探究UCP1表达是否改变肠道微生物群组成。
采集粪便样本，进行16S rRNA基因测序，分析菌群多样性和组成差异。
粪便代谢物（胆汁酸）分析
筛选与低脂肪相关的重要代谢物。
使用UPLC-TQMS靶向代谢组学分析粪便胆汁酸谱。
粪便微生物群移植验证
验证UCP1猪的菌群是否足以降低受体小鼠的脂肪沉积。
将WT和UCP1猪的粪便移植到抗生素处理的小鼠，饲喂CD或HFD，28天后分析表型和基因表达。
HDCA功能验证
确认HDCA直接调节脂质代谢。
口服给予小鼠HDCA，检测体重、脂肪质量及脂肪组织基因表达；在3T3-L1细胞中检测脂解作用。
机制解析
阐明UCP1表达如何通过脂肪-肝脏-肠道轴改变肠道菌群。
分析转录组数据、肝脏基因表达、血清和脂肪脂质组学，并用HepG2细胞验证PC对胆固醇合成的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
验证分子表达变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| DNA提取 | 天根粪便DNA提取试剂盒 | Tiangen | DP328 |
| DNA纯化 | QIAquick凝胶回收试剂盒 | Qiagen | 28706 |
| 16S rRNA测序 | MiSeq试剂盒V3 | Illumina | -- |
| FMT抗生素处理 | 新霉素 | Solarbio | N8090 |
| 链霉素 | Solarbio | S8290 | |
| 青霉素 | Solarbio | P8420 | |
| 万古霉素 | Solarbio | V8050 | |
| 甲硝唑 | Solarbio | M8060 | |
| 杆菌肽 | Solarbio | B8181 | |
| 环丙沙星 | Solarbio | C9710 | |
| 庆大霉素 | Solarbio | G8170 | |
| 氯霉素 | Solarbio | C8050 | |
| HDCA处理 | 油酸 | Solarbio | 08291 |
| 猪去氧胆酸 | Epsilon | Z-028 | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| RNA质量检测 | 微量分光光度计Nano100 | Nano Drop Technologies | -- |
| Agilent 2100生物分析仪 | Agilent | -- | |
| cDNA合成 | 高通量cDNA反转录试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 组织学分析 | Evos XL Core细胞成像系统 | Life Technologies | -- |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Lonza | -- |
| 胎牛血清（FBS） | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 3T3-L1分化 | 胰岛素 | -- | -- |
| 地塞米松 | -- | -- | |
| 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX） | -- | -- | |
| 罗格列酮 | -- | -- | |
| HepG2处理 | 磷脂酰肌醇（PI） | Yuanye | Y35772 |
| 磷脂酰胆碱（PC） | Sigma | P3556 | |
| 无脂肪酸牛血清白蛋白 | Applygen | -- | |
| 油红O染色 | 油红O | Solarbio | -- |
| 显微镜观察 | 显微镜（Leica） | Leica | -- |
| 蛋白提取 | T-PER组织蛋白提取试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| M-PER哺乳动物蛋白提取试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | -- | |
| Western blot | PVDF膜 | Millipore | -- |
| GAPDH抗体 | CST | -- | |
| HRP标记山羊抗兔IgG | -- | -- | |
| FluorChem M荧光成像系统（Tanon 5200） | Tanon Science & Technology Co., Ltd. | -- | |
| Pierce ECL Western印迹底物 | Thermo Scientific Pierce | -- | |
| p-AMPKα抗体 | Bioss | -- | |
| AMPKα1抗体 | CST | -- | |
| p-SREBF2抗体 | Affinity | -- | |
| SREBF2抗体 | Affinity | -- | |
| HMGCR抗体 | Solarbio | -- | |
| 甘油测定 | 甘油检测试剂盒 | Applygen | -- |
| 总胆固醇测定 | 总胆固醇（TC）含量检测试剂盒 | Boxbio | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 猪模型及饮食处理 | 猪的品种（Bama猪）、性别、月龄、饮食条件（CD或HFHC）、处理时长（HFHC 13个月）、屠宰及表型测量方法。 阅读提示：Materials and Methods: HFHC diet treatment and carcass trait measurements |
| 粪便微生物群分析 | 粪便采集时间点、DNA提取试剂盒、PCR扩增区域（V3-V4）、测序平台（MiSeq）、生物信息学分析流程（QIIME2、Greengenes数据库）。 阅读提示：Materials and Methods: DNA extraction and microbial community sequencing |
| FMT实验 | 受体小鼠品系、周龄、性别、抗生素混合物组成及浓度、预处理时间（7天）、粪便悬浮液制备方法（20mg/0.2mL）、灌胃剂量（0.2mL/鼠/天）、持续天数（28天）。 阅读提示：Materials and Methods: FMT |
| HDCA处理 | 小鼠品系、周龄、剂量（100μM/kg/天）、溶剂（油酸）、给药方式（口服）、持续时间（28天）、饮食条件（HFD）。 阅读提示：Materials and Methods: FMT（HDCA部分） |
| 3T3-L1细胞实验 | 细胞来源、分化条件（胰岛素、地塞米松、IBMX、罗格列酮）、HDCA处理浓度（5-50μM）和时间（2h或全分化期）。 阅读提示：Materials and Methods: Cell culture and differentiation in vitro |
| HepG2细胞实验 | 细胞来源、培养条件、PC和PI处理浓度（PC: 10,20μM; PI: 0.1-1μM）、处理时间（24h）、饥饿时间（12h）。 阅读提示：Materials and Methods: Cell culture and differentiation in vitro |
| 胆汁酸和脂质分析 | 样本类型（血清、粪便、iWAT）、分析方法（UPLC-TQMS、脂质组学）、样品制备和内部标准。 阅读提示：Materials and Methods: Lipid and bile acid determination |