小鼠繁殖与基因型鉴定
获取Ctsk-Cre报告小鼠并确认基因型，以确保Cre和报告基因的存在。
将Ctsk-Cre小鼠与tdT或nT-nG小鼠杂交，后代经基因分型，雄性Ctsk-Cre:tdT或nT-nG小鼠用于实验。
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使用GFP报告基因在单细胞水平可视化组织蛋白酶K-Cre表达
Visualizing Cathepsin K-Cre Expression at the Single-Cell Level with GFP Reporters.
实验完整度
高使用两种Cre报告小鼠和免疫荧光染色、dd-RT-PCR及组织透明化技术，在多个器官和组织中验证了Ctsk-Cre的表达。
主要模型
Ctsk-Cre转基因小鼠 tdT报告小鼠 nT-nG报告小鼠 B6小鼠
重点核对
Cre和报告基因的基因型验证 使用的报告基因（tdT或nT-nG） 小鼠年龄（1月、8月或10月等） 组织固定和脱钙条件 免疫荧光抗体和稀释度
摘要
我们使用两种GFP报告基因对主要器官和组织中Ctsk-Cre的表达进行了单细胞水平的全面分析。结果表明，Ctsk-Cre不仅在破骨细胞中表达，还在成骨细胞谱系细胞和其他主要器官/组织中表达，尤其是在脑、肾、胰腺和血管中。这些数据将有助于准确解读数据，以避免可能误导性的结论。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Ctsk-Cre在主要器官和组织中的表达是否仅限于破骨细胞？
- 核心机制
- Ctsk-Cre不仅表达于破骨细胞，还表达于成骨细胞谱系和其他多种细胞类型，其表达随年龄增长而变化。
- 主要证据
- 通过Ctsk-Cre报告小鼠的荧光成像、免疫荧光染色和dd-RT-PCR，在骨骼、脑、肾、胰腺、脂肪等组织中检测到Ctsk表达。
- 研究意义
- 该研究提供了Ctsk-Cre表达的全貌，有助于避免对使用该Cre系进行基因功能研究时的误解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
组织取材与处理
对多种组织和器官进行固定、脱钙、冷冻切片或组织透明化，以便后续成像分析。
采集骨骼和非骨骼组织，用4% PFA固定，硬组织用EDTA脱钙，然后进行冷冻切片或PEGASOS组织透明化处理。
荧光成像与单细胞分析
在单细胞水平观察Ctsk-Cre表达的位置和细胞类型。
使用共聚焦显微镜对冷冻切片或组织透明化样本成像，并通过形态学和免疫荧光染色识别细胞类型。
细胞类型鉴定
通过免疫荧光染色确认Ctsk表达细胞的特定身份。
用抗体对骨组织、脑、脂肪、肾脏等组织切片染色，识别成骨细胞、破骨细胞、神经元、巨噬细胞等。
体外培养验证
在体外培养的成骨细胞和破骨细胞中验证Ctsk表达。
从Ctsk-Cre报告小鼠分离BMSC和骨髓单核细胞，分别进行成骨和破骨分化培养，观察Ctsk表达。
表达水平验证
通过dd-RT-PCR定量验证Ctsk在各种组织中的表达水平。
提取10周龄B6小鼠各组织的RNA，用dd-RT-PCR测量Ctsk表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 冷冻切片 | 最适切割温度包埋剂 | -- | -- |
| 徕卡冷冻切片机CM1950 | Leica | -- | |
| 组织透明化 | 曲拉通X-100 | Sigma | -- |
| 叔丁醇 | -- | -- | |
| 成像 | 尼康A1 HD25共聚焦显微镜 | Nikon | -- |
| 免疫荧光 | DAPI | -- | -- |
| NeuN抗体 | Servicebio | GB11138 | |
| IBA1抗体 | Servicebio | GB113502 | |
| GFAP抗体 | Servicebio | GB11096 | |
| F4/80抗体 | Servicebio | GB113373 | |
| Neurogenin 3抗体 | Bioss | bs-0922R | |
| α-SMA抗体 | Servicebio | GB111364 | |
| I型胶原抗体 | Servicebio | GB11022-3 | |
| CD44抗体 | Servicebio | GB112054 | |
| Stra8抗体 | Bioss | bs-1903R | |
| Ucp1抗体 | Servicebio | GB112174 | |
| TH抗体 | Servicebio | GB11181 | |
| 降钙素受体抗体 | Bioss | bs-0124R | |
| 骨钙素抗体 | Servicebio | GB11233 | |
| Tracp/CD40 L抗体 | Servicebio | GB11416 | |
| 骨桥蛋白抗体 | Servicebio | GB11500 | |
| Sp7抗体 | Servicebio | GB111900 | |
| CD31抗体 | Servicebio | GB11063-2 | |
| EMCN抗体 | Santa Cruz | sc-65495 | |
| 细胞培养 | α-MEM培养基 | -- | -- |
| 抗坏血酸 | -- | -- | |
| β-甘油磷酸 | -- | -- | |
| 地塞米松 | -- | -- | |
| RANKL | Sino Biological | -- | |
| M-CSF | Sino Biological | -- | |
| RNA提取 | NucleoZOL | Macherey-Nagel | -- |
| 逆转录 | M5 Super qPCR RT试剂盒（含gDNA去除剂） | Mei5bio | -- |
| ddPCR | QX200微滴式数字PCR系统 | Bio-Rad | -- |
| QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | Bio-Rad | -- | |
| DG8卡盒 | Bio-Rad | -- | |
| 微滴生成油 | Bio-Rad | -- | |
| PCR板 | Bio-Rad | -- | |
| 统计 | GraphPad Prism | GraphPad | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠模型与基因型 | Ctsk-Cre和报告基因的基因型；年龄（1、2、8或10月龄） 阅读提示：Materials and Methods: Mice |
| 组织处理 | 固定时间、脱钙时间、切片厚度 阅读提示：Materials and Methods: Cryosectioning, Tissue clearing |
| 免疫荧光染色 | 抗体稀释度、封闭条件、洗涤时间 阅读提示：Materials and Methods: Immunofluorescence staining, Table 1 |
| 细胞培养 | 成骨或破骨分化诱导剂的浓度和培养时间 阅读提示：Materials and Methods: Culture of osteoclasts and osteoblasts |
| dd-RT-PCR | 引物序列、PCR程序、cDNA浓度 阅读提示：Materials and Methods: Droplet Digital PCR |