建立脓毒症小鼠模型并评估XBJ对肺损伤的改善作用
验证XBJ是否能够减轻脓毒症诱导的肺损伤。
采用盲肠结扎穿刺（CLP）建立脓毒症小鼠模型，给予不同剂量XBJ（3、9、18 ml/kg）尾静脉注射，24小时后评估生存率、肺组织病理（H&E染色）、肺湿干重比和血管通透性（伊文思蓝渗透）。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
血必净注射液通过降低Gasdermin D抑制中性粒细胞胞外诱捕网以逆转脓毒症小鼠肺损伤
Xuebijing injection inhibited neutrophil extracellular traps to reverse lung injury in sepsis mice via reducing Gasdermin D.
实验完整度
高该研究包含体内（CLP小鼠模型）和体外（分离中性粒细胞）两个独立证据层级，并通过功能验证（NETs形成抑制、肺损伤改善）和机制验证（GSDMD通路、抑制剂disulfiram）进行支持。
主要模型
CLP诱导的脓毒症小鼠模型 小鼠骨髓来源中性粒细胞
重点核对
CLP模型：雄性ICR小鼠，8周龄，22-25g，盲肠结扎穿刺（18号针头） XBJ给药：尾静脉注射，剂量为18 ml/kg（高剂量），给药1天 NETs诱导：体外使用500 nM PMA刺激中性粒细胞6小时 GSDMD抑制剂：disulfiram（10 μM体外，50 mg/kg腹腔注射，CLP后0、12、24小时） 检测指标：肺组织病理、湿干比、伊文思蓝渗透、NETs标志物（CitH3、MPO、NE）表达
摘要
脓毒症和脓毒性休克的死亡率在全球范围内仍然很高。中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的释放是脓毒症中器官衰竭和死亡的主要原因。靶向Gasdermin D（GSDMD）可以抑制NETs的形成，这对脓毒症的治疗很有前景。然而，目前尚未发现无严重安全性问题的药物用于此目的。血必净注射液（XBJ）已被证明可以缓解COVID-19和脓毒症患者的临床症状，但缺乏足够的动物研究来深入揭示其机制。因此，我们想知道XBJ是否通过抑制NETs形成来缓解脓毒症引起的肺损伤，并采用临床相关的多微生物感染模型来验证这一假设。首先，XBJ通过下调促炎趋化因子（如CSF-3、CXCL-2和CXCR-2）有效逆转了脓毒症引起的肺损伤，并抑制了中性粒细胞向肺部的募集。值得注意的是，我们发现XBJ显著降低了NETs成分蛋白的表达，包括瓜氨酸化组蛋白H3（CitH3）、髓过氧化物酶（MPO）和中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）。GSDMD有助于脓毒症中NETs的产生。值得注意的是，XBJ对GSDMD及其上游调节因子的表达表现出降低作用。此外，我们还发现XBJ通过抑制GSDMD相关基因的表达来逆转NETs的形成。总之，我们证明XBJ通过逆转GSDMD相关通路抑制NETs形成，从而保护脓毒症诱导的肺损伤。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 血必净注射液（XBJ）是否通过抑制NETs形成来缓解脓毒症诱导的肺损伤，并探索其潜在分子机制。
- 核心机制
- XBJ通过下调GSDMD表达及其上游调控因子（如caspase-11），抑制中性粒细胞NETs的形成。
- 主要证据
- 在CLP小鼠模型中，XBJ高剂量治疗显著减轻肺损伤（H&E、肺湿干比、伊文思蓝渗透），并降低NETs标志物（CitH3、MPO、NE）的表达；在体外，XBJ抑制PMA诱导的NETs形成，且在GSDMD抑制剂disulfiram存在时无叠加效应。
- 研究意义
- 该研究揭示了XBJ通过抑制GSDMD相关通路减少NETs形成，部分解释了其在脓毒症中的临床有效性，可能为COVID-19等疾病的治疗提供机制依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估XBJ对中性粒细胞募集的抑制
检测XBJ是否减少中性粒细胞向肺部的募集。
通过免疫荧光染色检测肺组织中Ly6G和MPO表达，流式细胞术检测支气管肺泡灌洗液（BALF）、骨髓和外周血的中性粒细胞比例，并检测肺部趋化因子（CSF-3、CXCL-2等）mRNA表达。
检测XBJ对NETs形成的抑制作用
验证XBJ是否抑制NETs的形成。
通过免疫荧光、免疫组化和Western blot检测肺组织中NETs标志物CitH3、NE和MPO的表达。体外实验中，分离骨髓中性粒细胞，用PMA刺激诱导NETs形成，并加入XBJ处理，检测CitH3、NE、MPO表达。
检测XBJ对GSDMD及其上游基因表达的影响
探究XBJ是否通过抑制GSDMD通路发挥作用。
通过Western blot和免疫荧光检测肺组织和中性粒细胞中GSDMD和caspase-11蛋白表达；RT-PCR检测GSDMD上游基因（caspase-11、caspase-1、HMGB1、IL-18）的mRNA水平。
验证GSDMD在XBJ抑制NETs形成中的关键作用
验证XBJ通过抑制GSDMD表达来减少NETs形成。
使用GSDMD抑制剂disulfiram（DIS）处理CLP小鼠和体外中性粒细胞，比较DIS、XBJ单独及联合处理对NETs标志物（MPO、CitH3、NE）的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | 三溴乙醇 | -- | -- |
| 药物处理 | 血必净注射液 | -- | Z20040033 |
| 免疫荧光 | 兔抗NE抗体 | Bioss | bs-23549R |
| 兔抗CitH3抗体 | Affinity | AF0863 | |
| 山羊抗兔IgG H&L（Alexa Fluor®488） | Abcam | ab150077 | |
| 山羊抗兔IgG H&L（Alexa Fluor®647） | Abcam | ab150115 | |
| FITC抗小鼠F4/80抗体 | Biolegend | 123107 | |
| PE抗小鼠Ly-6G抗体 | Biolegend | 127607 | |
| FITC抗小鼠MPO抗体 | Abcam | ab90812 | |
| DAPI | -- | -- | |
| 血管通透性 | 伊文思蓝 | Sigma-Aldrich | -- |
| RNA提取和逆转录 | Trizol试剂 | -- | -- |
| RT-PCR | 转录子第一链cDNA合成试剂盒 | Roche | -- |
| LightCycler 480 II 实时荧光定量PCR仪 | Roche | -- | |
| SYBR Green qPCR核心试剂盒 | Roche | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Solarbio | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | TransGen Biotech | PC0020 | |
| SDS-PAGE上样缓冲液 | Beyotime Biotechnology | P0015L | |
| 兔抗CitH3抗体 | -- | -- | |
| 兔抗caspase-11抗体 | Affinity | DF7609 | |
| 兔抗GSDMD抗体 | Affinity | AF4012 | |
| 兔抗CXCR-2抗体 | Bioss | bs-1629R | |
| 兔抗MPO抗体 | Abcam | ab208670 | |
| 兔抗GAPDH抗体 | Immunoway | YM3029 | |
| 山羊抗兔IgG二抗 | ZSbio | ZB-2301 | |
| EasySee Western Blot试剂盒 | TransGen Biotech | DW101-02 | |
| 免疫组化 | DAB显色试剂盒 | Boster Bio | AR1022 |
| 流式细胞术 | FITC抗小鼠CD11b抗体 | Biolegend | 101206 |
| 中性粒细胞分离 | Percoll分离液 | Sigma | -- |
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素和链霉素 | -- | -- | |
| 96孔板 | Costar | -- | |
| NETs诱导 | 佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯 | -- | -- |
| 免疫荧光 | 0.5% Triton X-100 | -- | -- |
| AlexaFluor 488偶联的山羊抗兔IgG抗体 | Abcam | -- | |
| AlexaFluor 555偶联的山羊抗兔IgG抗体 | Abcam | -- | |
| Hoechst 33342 | -- | H1399 | |
| 细胞刺激 | 脂多糖 | Sigma | L2880 |
| 三磷酸腺苷 | Sigma | A7699 | |
| 细胞死亡检测 | 碘化丙啶 | Solarbio | -- |
| 乳酸脱氢酶检测试剂盒 | Beyotime Biotechnology | C0016 | |
| 动物实验 | 双硫仑 | MedChemExpress | 97-77-8 |
| 芝麻油 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型 | 小鼠品系、性别、年龄、体重；CLP操作参数（针头规格、穿刺次数、粪便挤出量） 阅读提示：Methods：Cecal ligation puncture model |
| 药物处理 | XBJ剂量、给药途径、给药时间；对照组设置（Sham、CLP） 阅读提示：Methods：Cecal ligation puncture model；Figure 1 legend |
| 组织病理学 | 取材时间、固定液、切片厚度、染色方法 阅读提示：Methods：Hematoxylin and eosin staining；Figure 1 legend |
| 血管通透性 | 伊文思蓝剂量、给药时间、检测方法 阅读提示：Methods：Evans blue albumin permeability measurement；Figure 1 legend |
| 中性粒细胞分离与刺激 | 骨髓中性粒细胞分离方法（Percoll梯度浓度）、细胞纯度、刺激剂浓度（PMA、LPS、ATP）、刺激时间 阅读提示：Methods：The isolation of neutrophils；Visualization of NETs...；Figure 5 legend |
| NETs检测 | 抗体来源、稀释比例、孵育时间；检测指标（CitH3、NE、MPO） 阅读提示：Methods：Immunofluorescence assay；Western blotting；Immunohistochemistry assay |
| GSDMD通路验证 | GSDMD抑制剂disulfiram的浓度、给药方式、给药时间；检测基因（caspase-11、caspase-1、HMGB1、IL-18） 阅读提示：Methods：The application of GSDMD inhibitor；Figure 7 legend；Figure 8 legend |
| 统计分析 | 样本量、统计方法、显著性水平 阅读提示：Methods：Statistical analysis |