细胞毒性评估
确定SC和腺苷对HepG2和293T细胞的毒性，以选择合适的处理浓度。
使用MTT法检测不同浓度SC（250-2000 μg/mL）和腺苷（0.25-2.0 mM）处理细胞24小时后的细胞活力。
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裂褶菌降低SARS-CoV-2受体ACE2和TMPRSS2的表达
Schizophyllum commune Reduces Expression of the SARS-CoV-2 Receptors ACE2 and TMPRSS2.
实验完整度
中包含体外细胞实验（MTT、Western blot）和体内动物实验（急性毒性、组织病理、免疫组化、Western blot）及HPLC分析，但缺乏病毒感染模型和直接功能验证。
主要模型
HepG2细胞 293T细胞 C57BL/6小鼠模型
重点核对
SC浓度：500和1000 μg/mL，处理24小时 腺苷浓度：0.5和1.0 mM，处理24小时 小鼠模型：C57BL/6雌性小鼠，口服SC 1.0 g/kg，持续14天 急性毒性：ICR小鼠，口服SC 5 g/kg，观察14天
摘要
当前严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）引起的COVID-19全球大流行已感染数亿人，导致数百万人死亡，并持续构成威胁。它已成为人类历史上最大的流行病之一，给全球人民的生命和经济造成了巨大损失。然而，关于SARS-CoV-2对人类健康的影响仍存在许多不确定性，并持续受到关注。SARS-CoV-2进入宿主细胞是由病毒表面的刺突蛋白与细胞表面受体血管紧张素转换酶2（ACE2）结合促进的。此外，跨膜蛋白酶丝氨酸2（TMPRSS2）是一种宿主表面蛋白酶，可切割并蛋白水解激活其S蛋白，这对病毒感染是必需的。因此，SARS-CoV-2利用ACE2受体进入细胞，并利用TMPRSS2蛋白酶启动S蛋白。裂褶菌（SC）是分布最广泛的真菌之一，常见于树木的朽木上，已被发现具有多种健康益处，包括抗癌、抗菌活性、抗寄生虫和免疫调节功能。在本文中，SC在体外和体内显著降低了ACE2和TMPRSS2蛋白的表达，且不造成细胞损伤。此外，来自SC的腺苷在本实验中也同样被证明可降低ACE2和TMPRSS2的表达。因此，我们的研究结果表明，SC和腺苷通过ACE2和TMPRSS2轴展现出抑制SARS-CoV-2感染的潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- SC及其成分腺苷能否通过下调ACE2和TMPRSS2表达来抑制SARS-CoV-2感染？
- 核心机制
- SC和腺苷通过降低宿主细胞表面受体ACE2和蛋白酶TMPRSS2的表达，可能阻碍SARS-CoV-2进入细胞。
- 主要证据
- 体外Western blot显示SC（500、1000 μg/mL）和腺苷（0.5、1.0 mM）处理HepG2和293T细胞24小时显著降低ACE2和TMPRSS2蛋白表达；体内实验显示口服SC（1.0 g/kg）14天降低小鼠肝、肾、肺组织中ACE2和TMPRSS2表达（免疫组化和Western blot）。
- 研究意义
- 研究表明SC和腺苷可作为潜在食品营养补充剂，通过抑制ACE2和TMPRSS2表达来抑制SARS-CoV-2感染。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外表达抑制验证
验证SC和腺苷是否能降低HEPG2和293T细胞中ACE2和TMPRSS2蛋白的表达。
Western blot检测SC（500、1000 μg/mL）和腺苷（0.5、1.0 mM）处理细胞24小时后ACE2和TMPRSS2蛋白水平。
急性口服毒性试验
评估SC口服给药的安全性。
ICR小鼠单次口服SC 5 g/kg，观察14天，记录死亡、行为、外观和体重，确定LD50。
体内表达抑制验证
验证口服SC能否在小鼠组织中降低ACE2和TMPRSS2表达。
C57BL/6小鼠口服SC（1.0 g/kg）14天后，通过免疫组织化学和Western blot检测肝、肾、肺组织中ACE2和TMPRSS2表达。
HPLC分析
定量SC中腺苷含量，作为质量控制标记。
使用HPLC-PAD分析SC水提物中腺苷含量，以腺苷标准品为参照，保留时间8.3分钟，含量14.21 μg/mL。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 细胞活力检测 | MTT检测试剂盒 | Med-ChemExpress | HY-15924 |
| 蛋白质提取 | RIPA裂解液 | GENESTAR | -- |
| 蛋白质定量 | Bio-Rad蛋白检测试剂盒 | BioRad | -- |
| Western blot | ACE2一抗 | Genetex | GTX101395 |
| TMPRSS2一抗 | Genetex | GTX100743 | |
| 山羊抗兔IgG抗体（HRP） | Arigo | ARG65351 | |
| ECL底物 | Merck | 201765 | |
| 免疫组织化学 | ACE2抗体 | Bioss Inc. | bs-1004R |
| TMPRSS2抗体 | Abcam | ab214462 | |
| 组织病理 | 尼康ECLIPSE TS100显微镜 | Nikon | -- |
| HPLC | 高效液相色谱系统 | Hitachi | -- |
| TSKgel Tosoh ODS-80Tm色谱柱 | Tosoh | -- | |
| 数据处理 | Image J软件 | -- | -- |
| 统计分析 | SPSS统计分析软件21.0 | SPSS, Inc. | -- |
| Western blot detection | 柯达分子成像软件 | East-man Kodak Company | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养和处理 | 细胞系：HepG2和293T；培养基：DMEM+10%FBS；培养条件：37°C、5% CO2；细胞密度：2.5×10^4 cells/well（六孔板）；处理前培养24小时；处理浓度和时间：SC 500、1000 μg/mL，腺苷0.5、1.0 mM，处理24小时。 阅读提示：Materials and Methods 4.2节 |
| 细胞活力检测 | 细胞密度：2.5×10^4 cells/well（96孔板）；处理浓度：SC 0-1000 μg/mL，腺苷0-2 mM；处理时间：24小时；MTT孵育时间：至少3小时；检测波长570 nm。 阅读提示：Materials and Methods 4.3节 |
| Western blot | 蛋白提取：RIPA缓冲液；离心：10,000×g、4°C、10分钟；蛋白定量：Bio-Rad蛋白检测试剂盒；电泳：100V，90分钟；转膜：200mA，2小时；一抗：ACE2 (GTX101395) 1:1500，TMPRSS2 (GTX100743) 1:1500；二抗：山羊抗兔IgG (HRP) 1:5000；ECL底物检测。 阅读提示：Materials and Methods 4.4节 |
| 动物实验 | 急性毒性：ICR小鼠，雌雄兼用，6-8周龄，体重25-30g，口服SC 5g/kg，观察14天；体内模型：雌性C57BL/6小鼠，6-8周龄，体重18-20g，口服SC 1.0g/kg，连续14天，每组n=6；组织收集：肝、肾、肺。 阅读提示：Materials and Methods 4.5和4.6节 |
| 组织学和免疫组化 | 组织固定、石蜡包埋、切片、H&E染色；IHC一抗：ACE2 (bs-1004R, 1:50)，TMPRSS2 (ab214462, 1:200)；图像采集：Nikon ECLIPSE TS100显微镜；定量：Image J软件。 阅读提示：Materials and Methods 4.7和4.8节 |
| HPLC分析 | 色谱柱：TSKgel Tosoh ODS-80Tm (250×4.6mm, 5μm)；流动相：乙腈(A)和0.4%乙酸(B)，梯度洗脱（详细梯度见Methods）；流速：1 mL/min；检测波长254 nm；腺苷标准品保留时间8.3分钟。 阅读提示：Materials and Methods 4.9节 |