骨形态发生蛋白-7与三氧化矿物凝聚体联合应用对人牙髓干细胞增殖、迁移和分化的影响

Combined effects of bone morphogenetic protein-7 and mineral trioxide aggregate on the proliferation, migration, and differentiation of human dental pulp stem cells.

作者信息Selen Küçükkaya Eren, Elham Bahador Zirh, Selim Zirh, Parisa Sharafi, Naciye Dilara Zeybek
PMID36102412
发布时间2022-09-09
DOI10.1590/1678-7757-2022-0086

实验完整度

含细胞培养、增殖、分化、迁移等体外实验,但缺乏体内模型或临床验证。

主要模型

人牙髓干细胞(DPSCs,Lonza PT-5025)

重点核对

细胞系:人牙髓干细胞(DPSCs,Lonza PT-5025),第3代 MTA制备:MTA粉末与蒸馏水按1g:0.3mL混合,制成直径5mm、高2mm的圆片 BMP-7浓度:增殖实验用25、50、100 ng/mL,后续实验选用50 ng/mL 培养条件:37°C、5% CO2,生长或分化培养基,每两天换液 检测指标:WST-1增殖、ALP活性、茜素红染色、RT-qPCR(DMP1、DSPP、nestin)、伤口愈合

摘要

摘要 生物活性分子有望与生物材料联合应用于活髓治疗和再生性牙髓治疗。目的 本研究的目的是评估骨形态发生蛋白-7(BMP-7)与三氧化矿物凝聚体(MTA)联合使用对人牙髓干细胞(DPSCs)增殖、迁移和分化的影响。方法 在增殖分析中,DPSCs用生长培养基培养,并用不同浓度的MTA和/或BMP-7处理。在后续分析中,DPSCs用分化培养基培养,并用MTA和/或BMP-7处理。此外,还有DPSCs用生长培养基(对照)、分化培养基或含胎牛血清的DMEM/F12培养,且不添加MTA或BMP-7的组。细胞增殖用WST-1法分析。成牙/成骨分化用免疫细胞化学、碱性磷酸酶(ALP)活性测定、茜素红染色和逆转录定量聚合酶链反应(RT-qPCR)评估。细胞迁移用伤口愈合实验评估。数据用方差分析和Tukey检验分析(p=0.05)。结果 与单独使用MTA相比,BMP-7与MTA联合使用对细胞增殖无显著影响(p>0.05),但与其他组相比,ALP活性更高,矿化增加,DMP1和DSPP表达更高(p<0.05)。Nestin表达在对照组中高于MTA和/或BMP-7组(p<0.05)。与MTA处理相比,MTA处理组的细胞迁移率在所有时间段均增加(p<0.05)。72小时时,MTA和/或BMP-7组的伤口面积小于对照组(p<0.05)。结论 BMP-7与MTA联合使用增加了成牙/成骨分化,而不影响DPSCs的增殖和迁移。BMP-7与MTA联合使用可能通过增加DPSCs的修复和再生能力来改善治疗结果。关键词 硅酸钙,细胞毒性,成骨蛋白-1,牙髓切断术,再生性牙髓治疗

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
BMP-7与MTA联合使用对人牙髓干细胞增殖、迁移和分化的影响。
核心机制
BMP-7与MTA联合使用通过促进成牙/成骨分化(高DMP1和DSPP表达,低Nestin表达)增强DPSCs的修复和再生能力。
主要证据
体外实验显示联合组ALP活性最高、矿化增加、DMP1和DSPP表达上调,且增殖和迁移不受影响。
研究意义
在活髓治疗和再生性牙髓治疗中,联合应用BMP-7和MTA可能通过改善DPSCs的成牙/成骨分化来增强修复和再生过程。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

细胞培养与材料制备

建立体外细胞模型并制备实验用MTA和BMP-7。

培养人牙髓干细胞(DPSCs)至第3代,制备MTA圆片,并配置不同浓度的重组人BMP-7。

2

增殖实验

评估MTA和不同浓度BMP-7单独或联合使用对DPSCs增殖的影响。

DPSCs与MTA和/或不同浓度BMP-7共培养1、3、5天,用WST-1法检测细胞活力。

3

成牙/成骨分化诱导

评估MTA和BMP-7联合使用对DPSCs成牙/成骨分化的影响。

DPSCs在分化培养基中与MTA和/或BMP-7(50 ng/mL)共培养21天,进行一系列分化相关检测。

4

迁移实验

评估MTA和BMP-7对DPSCs迁移能力的影响。

通过伤口愈合实验,在0、24、48、72小时测量伤口闭合率。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
DPSC生长培养基套装LonzaPT-3005
DMEM/F12培养基Capricorn--
胎牛血清CapricornFBS-12B
青霉素/链霉素CapricornPS-B
地塞米松Sigma-AldrichD4902-100MG
L-抗坏血酸Sigma-AldrichA4403-100MG
甘油磷酸盐Sigma-AldrichG9422-50G
三氧化矿物凝聚体DENTSPLY Tulsa Dental Specialties--
重组人骨形态发生蛋白-7BioVision4579-10
WST-1试剂Roche Applied Science--
Transwell小室Corning--
抗DMP1抗体Biossbs-12359R
抗DSPP抗体Biossbs-10316R
抗Nestin抗体Biossbs-0008R
山羊抗小鼠FITCSigma-AldrichF9006
驴抗兔Alexa Fluor 568InvitrogenA10042
DAPI封片剂Thermo Fisher ScientificP36962
茜素红S溶液Sigma-Aldrich--
ALP比色法试剂盒BioVision--
RNeasy Mini试剂盒Qiagen--
ProtoScript II逆转录酶New England Biolabs--
QuantiTect SYBR Green PCR试剂盒Qiagen--
倒置显微镜LeicaDMI4000B
荧光显微镜LeicaDMI6B
相机LeicaDFC7000T
酶标仪Molecular DevicesVersaMax
热循环仪QiagenRotor Gene-Q

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
细胞培养
DPSCs细胞系、代数、培养条件(37°C、5% CO2)、培养基
阅读提示:Methods - Cell culture
材料制备
MTA与水的比例、模具尺寸、固化时间、灭菌方式;BMP-7浓度
阅读提示:Methods - Preparation of materials
增殖实验
细胞密度、培养时间(1、3、5天)、MTA和BMP-7浓度、检测方法
阅读提示:Methods - Proliferation assay
分化实验
分化培养基成分、MTA和BMP-7浓度、培养时间(21天)、检测方法
阅读提示:Methods - Odontogenic/osteogenic differentiation, Figure 1
迁移实验
细胞密度、划痕方法、观察时间点(0、24、48、72小时)
阅读提示:Methods - Wound healing