Sox6差异调控源自快肌和慢肌的卫星细胞的固有生肌能力与肌纤维类型

Sox6 Differentially Regulates Inherited Myogenic Abilities and Muscle Fiber Types of Satellite Cells Derived from Fast- and Slow-Type Muscles.

作者信息Zihao Zhang, Shudai Lin, Wen Luo, Tuanhui Ren, Xing Huang, Wangyu Li, Xiquan Zhang
PMID36232654
发布时间2022-09-26
DOI10.3390/ijms231911327

实验完整度

包含细胞模型(PM-MBs/LM-MBs)、分子机制验证(双荧光素酶、Co-IP、Western blot、qPCR)及功能验证(增殖、分化、自我更新)等多层级证据。

主要模型

鸡胸肌来源卫星细胞(PM-MBs)及其肌管(PM-MTs) 鸡腿肌来源卫星细胞(LM-MBs)及其肌管(LM-MTs)

重点核对

卫星细胞分离来源(胸肌PM vs 腿肌LM) Sox6过表达/抑制的处理条件 分化培养基(DM)处理天数(3或4天) Nfix和Mef2C的过表达/抑制及共转染 EdU标记时间(增殖6小时,自我更新24小时)

摘要

成年骨骼肌主要分为快肌和慢肌,它们在再生能力、代谢和收缩性方面具有显著差异。卫星细胞在成年骨骼肌中起着重要作用。然而,卫星细胞肌发生的潜在机制尚不清楚。我们之前发现Sox6在成年快肌中高表达。因此,我们旨在验证来自不同肌纤维类型的卫星细胞的肌发生,并研究Sox6对卫星细胞肌发生的调控。首先,我们分别从快肌和慢肌中分离卫星细胞。我们发现,来自不同肌纤维类型的卫星细胞形成的肌管与其来源类型相似。此外,我们观察到来自快肌的细胞比来自慢肌的细胞具有更高的增殖效率,但更低的自我更新潜能。然后,我们证明Sox6促进卫星细胞衍生的肌管向固有肌纤维类型发展。我们揭示,在快速型肌肉来源的生肌细胞分化过程中,Nfix的较高表达通过与Sox6结合抑制慢型亚型(MyH7B、Tnnc1)的转录。另一方面,在Nfix低表达的慢型肌肉来源的生肌细胞中,Sox6激活Mef2C以促进慢肌纤维形成,显示了Sox6对卫星细胞发育调控的不同效应。我们的发现表明,生肌祖细胞卫星细胞倾向于向与其起源相似的纤维类型发展。Sox6和Nfix的表达部分解释了来自快肌和慢肌的生肌细胞的发展差异。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
源自快肌和慢肌的卫星细胞是否具有不同的肌生成潜能,以及Sox6如何调控这种差异?
核心机制
在快肌来源的PM-MTs中,分化过程中Nfix高表达,与Sox6结合形成复合物,抑制慢型亚型(MyH7B、Tnnc1)的转录;在慢肌来源的LM-MTs中,Nfix低表达不足以抑制Sox6对Mef2C的激活,从而促进慢型亚型的表达。同时,Sox6直接促进快型亚型(MyH1A、Tnnc2、Tnni2、Tnnt3)的转录。
主要证据
PM-MBs和LM-MBs的增殖、分化及纤维类型形成差异;Sox6过表达/抑制的qPCR、Western blot和免疫荧光结果;Nfix差异表达及Co-IP和双荧光素酶实验证明Sox6与Nfix结合抑制慢型亚型,Sox6激活Mef2C促进慢型亚型。
研究意义
该发现部分解释了来自不同肌肉的卫星细胞肌发生的差异,有助于拓宽对卫星细胞肌发生和鸡骨骼肌发育分子机制的理解。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

分离卫星细胞并比较其肌生成能力

验证快肌和慢肌来源的卫星细胞是否具有不同的增殖、自我更新和分化能力。

从3日龄鸡胸肌(PM)和腿肌(LM)分离卫星细胞,通过EdU染色检测增殖,qPCR检测分化和纤维类型标志物,免疫荧光检测肌管中慢型和快型MyHC的比例。

2

在PM-MBs中过表达或抑制Sox6

确定Sox6对快肌来源卫星细胞增殖、分化和纤维类型形成的影响。

在PM-MBs中过表达或敲低Sox6,通过qPCR、Western blot、免疫荧光检测纤维类型标志物,通过EdU和流式细胞术检测增殖,通过Pax7/EdU染色评估自我更新。

3

在LM-MBs中过表达或抑制Sox6

比较Sox6对慢肌来源卫星细胞的功能影响,观察其是否与PM-MBs不同。

在LM-MBs中过表达或敲低Sox6,检测增殖、分化和纤维类型标志物。

4

分析Nfix差异表达及与Sox6的相互作用

探索Nfix在PM-MTs和LM-MTs中的差异表达及其对Sox6调控慢型纤维的作用。

通过qPCR和Western blot检测Nfix在PM-MTs和LM-MTs中的表达,通过免疫荧光观察定位,通过Co-IP验证蛋白结合,通过双荧光素酶实验检测MyH7B和Tnnc1启动子活性。

5

验证Sox6对Mef2C的调控

确定Sox6是否通过激活Mef2C促进慢型纤维形成,并检测Nfix的干扰作用。

在PM-MTs和LM-MTs中过表达或抑制Sox6后检测Mef2C表达,通过双荧光素酶实验验证Sox6对Mef2C启动子的直接作用,以及Mef2C对慢型亚型启动子的作用。

6

功能验证Nfix和Mef2C的作用

通过改变Nfix和Mef2C的表达验证其是否模拟或逆转Sox6对慢型纤维的效应。

在PM-MTs中敲低Nfix并过表达Sox6,或在LM-MTs中共过表达Nfix和Sox6,或抑制Mef2C,检测慢型和快型纤维标志物的变化。

7

验证Sox6对快型亚型启动子的直接作用

确认Sox6是否直接激活快型亚型基因的转录,且不依赖Nfix。

在DF-1细胞中利用双荧光素酶报告载体检测Sox6对MyH1A、Tnnc2、Tnni2、Tnnt3启动子的作用,并用截短启动子定位关键区域。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

细胞培养与分化
验证细胞增殖与自我更新
验证蛋白-蛋白相互作用
验证转录调控机制

产品清单

实验环节名称品牌货号
I型胶原酶Solarbio--
胰蛋白酶Solarbio--
DMEM/F12培养基Invitrogen--
胎牛血清Gibco--
青霉素-链霉素Gibco--
马血清Gibco--
磷酸盐缓冲液Solarbio--
Triton X-100Solarbio--
牛血清白蛋白Solarbio--
山羊血清Solarbio--
DAPIBeyotime--
抗Pax7抗体Sangon BiotechD121107
抗MyH1A抗体(F59)DHSB--
抗MyH7B抗体(S58)DHSB--
抗Nfix抗体(2D3)DHSB--
抗MyHC抗体(b103)DHSB--
抗Sox6抗体Biossbs-21580R
FITC标记二抗Sangon Biotech--
RBITC标记二抗Sangon Biotech--
Alexa Fluor 488标记二抗Sangon Biotech--
Alexa Fluor 555标记二抗Sangon Biotech--
Leica DMi8荧光显微镜Leica--
Leica TCs SP8共聚焦显微镜Leica--
Cell-Light EdU Apollo体外试剂盒RiboBio--
FxCycle™ PI/RNase染色液Invitrogen--
BD Accuri C6流式细胞仪BD Biosciences--
RNAiso Plus试剂Takara--
PrimerScript RT试剂盒(含gDNA Eraser)Takara--
iTaq Universal SYBR Green Supermix试剂盒Bio-Rad--
QuantStudio 5实时荧光定量PCR系统Applied Biosystems--
pcDNA3.1载体Invitrogen--
pGL3-basic荧光素酶报告载体Promega--
Lipofectamine 3000转染试剂Invitrogen--
OPTI-MEM减血清培养基Gibco--
RIPA裂解液Beyotime--
PMSF蛋白酶抑制剂Beyotime--
PVDF膜Bio-Rad--
QuickBlock™ Western封闭液Beyotime--
Dylight 680标记二抗Bioworld--
Odyssey Fc成像系统LI-COR--
Dual-Glo®荧光素酶检测系统Promega--
Synergy™ Neo 2多功能酶标仪Biotek--
Pierce免疫共沉淀试剂盒Thermo Scientific--
IgG抗体Biossbs-0310G

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
卫星细胞分离
鸡的日龄(3日龄)和肌肉来源(胸肌、腿肌);酶消化条件(0.1%胶原酶I 30分钟,0.25%胰蛋白酶1小时);离心和过滤条件(70 μm滤网,1500 rpm 8分钟)
阅读提示:Materials and Methods 4.2
细胞培养与分化
生长培养基组成(DMEM/F12+20%FBS+双抗);分化培养基(DMEM/F12+5%马血清+双抗);培养条件(37°C,5% CO2,100%湿度);分化时间(3-5天)
阅读提示:Materials and Methods 4.2和结果图1-8
Sox6过表达/抑制
过表达载体(pcDNA3.1-Sox6);siRNA序列及浓度(未明确);转染试剂(Lipofectamine 3000);转染后时间(未明确)
阅读提示:Materials and Methods 4.6
Nfix和Mef2C调控实验
过表达载体(pcDNA3.1-Nfix, pcDNA3.1-Mef2C);siRNA序列及浓度(未明确);双荧光素酶实验的时间(48小时)
阅读提示:Materials and Methods 4.6和4.8
免疫荧光
抗体稀释比例(Pax7 1:500, MyH1A 1:100, MyH7B 1:100, Nfix 1:50, MyHC 1:500, Sox6 1:500);孵育条件(一抗4°C过夜,二抗室温1小时)
阅读提示:Materials and Methods 4.3和结果图1-7
Westen blot
抗体稀释比例(MyH1A 1:100, MyH7B 1:100, Nfix 1:50, β-actin 1:1000);蛋白质提取条件(RIPA+ PMSF,冰上15分钟,离心13,000×g 10分钟)
阅读提示:Materials and Methods 4.7
双荧光素酶报告实验
报告载体(pGL3-basic,不同启动子片段);内参(TK-Renilla);检测时间(转染后48小时)
阅读提示:Materials and Methods 4.8
免疫共沉淀
抗体量(75 μg);洗涤和洗脱步骤(按试剂盒);样品处理(加入5×SDS样品缓冲液,100°C煮5分钟)
阅读提示:Materials and Methods 4.9