观察原发肿瘤中交感神经纤维浸润
验证实验条件下交感神经纤维是否浸润原发肿瘤及其周围。
皮下接种3LL细胞形成肿瘤后，用抗酪氨酸羟化酶（Th）抗体染色，观察肿瘤内及周围皮肤中的交感神经纤维。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
交感神经系统促进肺转移前微环境的建立
The Sympathetic Nervous System Contributes to the Establishment of Pre-Metastatic Pulmonary Microenvironments.
实验完整度
高包含化学交感神经切除动物模型、体外细胞实验、Sema3A敲除小鼠观察及β受体阻滞剂干预等多个独立证据层级，并包含功能验证和机制验证。
主要模型
小鼠化学交感神经切除模型 3LL细胞皮下移植瘤模型 J774.1巨噬细胞与PC12神经元共培养体外模型 Sema3A敲除小鼠
重点核对
6-OHDA剂量与给药方案：100 mg/kg腹腔注射，每周三次，从肿瘤接种前2周至处死 肿瘤细胞接种数量：2×10^5 3LL-EGFP细胞或5×10^5 LLC细胞皮下接种 肺转移检测：自发转移实验在3LL细胞接种后3周处死，转移前分析在LLC细胞接种后2周处死 β受体阻滞剂普萘洛尔给药：每日腹腔注射，从肿瘤接种后3天至处死 统计分析：两组比较采用双尾配对Student's t检验，p<0.05
摘要
新出现的证据表明神经活动有助于肿瘤的发生及其获得转移特性。更具体地说，已有报道称交感神经系统调节肿瘤血管生成、肿瘤生长和转移。交感神经系统在原发肿瘤中的功能已逐渐被阐明。然而，其在转移前微环境和/或远离原发部位的转移环境的准备中的功能仍不清楚。为了研究交感神经系统在转移前微环境中的作用，我们用6-OHDA对小鼠进行了化学交感神经切除术，并观察到通过减弱髓源性抑制细胞的募集而减少肺转移。此外，我们注意到在荷瘤小鼠肺中可以观察到神经-免疫细胞相互作用，同时Sema3A表达降低。这些数据表明，交感神经系统有助于肺中转移前微环境的准备，这是由神经-免疫细胞相互作用介导的。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 交感神经系统是否参与并如何调节肺转移前微环境的建立？
- 核心机制
- 交感神经通过β2肾上腺素受体与巨噬细胞相互作用，上调S100A8表达，进而募集MDSCs至肺转移前微环境；同时，肺中Sema3A表达下降导致神经完整性丧失，促进神经-免疫细胞相互作用。
- 主要证据
- 化学交感神经切除减少肺转移和MDSC募集，降低肺中S100A8表达；体外β2激动剂上调S100A8，拮抗剂阻断；Sema3A敲除小鼠肺中神经末梢异常分支并与CD11b阳性细胞相互作用。
- 研究意义
- 本研究首次报道交感神经纤维末端与巨噬细胞相互作用并通过β2肾上腺素受体增强S100A8表达，从而在肺转移前微环境中募集MDSCs，为神经-免疫相互作用在转移前微环境中的作用提供了新见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
化学交感神经切除并检测原发肿瘤血管生成
确定交感神经系统对原发肿瘤生长和血管生成的作用。
通过腹腔注射6-OHDA进行化学交感神经切除，检测肿瘤血管生成和血管周细胞覆盖。
评估化学交感神经切除对肺转移的影响
探讨交感神经在肺转移过程中的作用。
使用表达GFP的3LL细胞进行自发转移实验，检测肺转移灶数量、gfp mRNA水平及循环肿瘤细胞数量。
分析肺转移前微环境中MDSC的募集
考察交感神经切除对肺转移前微环境中MDSC募集的影响。
通过流式细胞术和免疫荧光染色分析肺中CD11b阳性细胞、单核细胞MDSC和炎性单核细胞的数量，并检测S100A8表达。
检测骨丢失及探索相关因子
探究荷瘤小鼠骨丢失现象及其可能的分子机制。
通过组织学测量股骨骨量，检测血清G-CSF水平和Sema3A mRNA表达。
观察肺中神经-免疫细胞相互作用
验证Sema3A表达降低是否导致神经纤维异常并促进神经-免疫细胞相互作用。
使用CUBIC透明化技术观察完整肺叶中神经纤维形态；免疫荧光染色观察神经纤维与CD11b阳性细胞接触；体外共培养PC12细胞和J774.1细胞模拟相互作用。
验证β2肾上腺素受体介导的S100A8上调
确认巨噬细胞中β2肾上腺素受体信号是否诱导S100A8表达。
用β2激动剂特布他林、β3激动剂CL316,243刺激J774.1细胞，或与β2拮抗剂ICI118,551共处理，检测S100a8 mRNA表达。
评估β受体阻滞剂对肺转移的影响
探讨β受体阻滞剂普萘洛尔是否能抑制肺转移。
给荷瘤小鼠腹腔注射普萘洛尔，检测实验性肺转移和自发转移，以及肺中S100a8和Ccl2 mRNA表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫荧光染色 | 抗酪氨酸羟化酶抗体 | Merck Millipore | AB152 |
| 流式细胞术 | Alexa647偶联抗Adrb2抗体 | Bioss | BS-0947R-A647 |
| 免疫荧光染色 | FITC偶联抗平滑肌肌动蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | F3777 |
| 抗Tuj1抗体 | BioLegend | PRB-435P | |
| 流式细胞术 | 抗F4/80抗体 | BioLegend | 123114 |
| 免疫印迹 | 抗神经丝蛋白L抗体 | Cell Signaling Technology | 2837 |
| 抗肌动蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 4970 | |
| 免疫荧光染色 | 抗CD31抗体 | BD Biosciences | 550274 |
| MECA-32抗体 | BD Biosciences | 550563 | |
| 流式细胞术 | 抗CD11b抗体 | BD Biosciences | 57397 |
| 抗Ly-6c抗体 | BD Biosciences | 560593 | |
| 抗Ly-6G抗体 | BD Biosciences | 551460 | |
| 抗CD11c抗体 | BD Biosciences | 117346 | |
| 免疫印迹和免疫荧光 | 抗Sema3A抗体 | Abcam | ab199475 |
| 药物处理 | 特布他林 | Sigma-Aldrich | -- |
| ICI118,551 | Sigma-Aldrich | -- | |
| CL316,243 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 免疫印迹 | 抗S100A8抗体 | Santa Cruz Biotechnology | SC-812 |
| 药物处理 | 6-羟基多巴胺盐酸盐 | Sigma-Aldrich | -- |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Fujifilm Wako | -- |
| RNA提取 | ISOGEN II试剂 | Nippon Gene | -- |
| 逆转录 | ReverTra Ace qPCR RT预混液 | TOYOBO | -- |
| qPCR | Step-One plus实时荧光定量PCR仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 细胞分离 | MoFlo Astorios流式分选仪 | Beckman Coulter | -- |
| 细胞培养 | G418抗生素 | -- | -- |
| 动物实验 | 普萘洛尔 | -- | -- |
| 肺透明化处理 | CUBIC-L透明化试剂 | Tokyo Chemical Industry | -- |
| CUBIC-R透明化试剂 | Tokyo Chemical Industry | -- | |
| 显微镜观察 | LSM710共聚焦显微镜 | Zeiss | -- |
| 体视显微镜 | LEICA Microsystems | -- | |
| 流式细胞术 | CytoFLEX流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 化学交感神经切除 | 6-OHDA剂量为100 mg/kg，腹腔注射，每周三次，从肿瘤接种前2周持续至处死 阅读提示：见材料与方法4.4动物研究 |
| 肿瘤接种与转移分析 | 3LL-EGFP细胞接种量为2×10^5，LLC细胞接种量为5×10^5；自发转移实验在3LL接种后3周处死，转移前分析在LLC接种后2周处死 阅读提示：见材料与方法4.4动物研究及结果2.2、2.3 |
| β受体阻滞剂处理 | 普萘洛尔每日腹腔注射，从肿瘤接种后3天至处死 阅读提示：见结果2.6及材料与方法4.4动物研究 |
| 体外β2受体激动剂实验 | J774.1细胞刺激浓度和时间未在文中明确说明，但验证了特异性激动剂和拮抗剂的作用 阅读提示：见结果2.5及图5D,E |