疏风解毒胶囊通过激活A2AAR和抑制NF-κB减轻LPS诱导的急性肺损伤,抑制炎症和细胞凋亡

Shufeng Jiedu capsule inhibits inflammation and apoptosis by activating A2AAR and inhibiting NF-κB to alleviate LPS-induced ALI.

作者信息Junnan Cai, Yu-Lian Wang, Xiao-Dong Sheng, Lei Zhang, Xiongwen Lv
PMID36002086
发布时间2022-11-15
DOI10.1016/j.jep.2022.115661

实验完整度

包含动物模型(LPS诱导ALI小鼠)和体外细胞模型(RAW264.7、A549),并结合Western blot、ELISA、流式细胞术、TUNEL、免疫荧光等多种方法进行功能与机制验证。

主要模型

LPS诱导的ALI小鼠模型(C57/BL6J小鼠) RAW264.7小鼠单核巨噬细胞 A549人肺腺癌细胞

重点核对

SFJDC给药剂量:0.1、0.3、0.5 g/kg,连续灌胃7天 LPS造模剂量:5 mg/kg,腹腔注射,0.2 mL RAW264.7细胞处理:SFJDC 0.5 mg/mL预处理1小时,LPS 1 μg/mL处理24小时 A549细胞与RAW264.7上清液共培养24小时 体内实验每组6只小鼠,体外实验每组3个重复

摘要

民族药理学相关性:疏风解毒胶囊(SFJDC)是一种纯中药制剂,含有八种药用植物。以其抗炎和解热作用而闻名,主要用于治疗上呼吸道感染和其他感染性疾病,如感冒、咽炎、喉炎和扁桃体炎。急性肺损伤(ALI)和COVID-19都与肺损伤密切相关,主要表现为肺部炎症和上皮细胞损伤。然而,SFJDC是否能改善ALI及其机制尚不清楚。本研究的目的是探讨SFJDC是否可以通过改善急性肺损伤来作为COVID-19的预防性治疗。研究目的:本研究的目的是确定SFJDC是否可以保护免受脂多糖(LPS)引起的ALI,并希望从药理学和分子学上确定SFJDC如何减少炎症和细胞凋亡。材料与方法:预先给予SFJDC 0.1 g/kg、0.3 g/kg或0.5 g/kg一周,然后给予5 mg/kg LPS诱导小鼠ALI。观察包括肺组织形态学、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-6(IL-6)的分泌,以及肺湿/干重比。此外,RAW264.7细胞在用0.5 mg/mL SFJDC预处理1小时后,用1 μg/mL LPS处理24小时。在样本中检测了TNF-α、IL-1β和IL-6。通过用RAW264.7上清液刺激A549细胞24小时检测细胞凋亡。在体外和体内,均使用Western blot分析测定了A2A腺苷受体(A2AAR)、PKA、IκB、p-IκB、NF-κB P65(P65)、p-NF-κB P65(p-P65)、cleaved caspases-3(Cc3)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)和B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)蛋白的水平。结果:SFJDC减少了细胞因子分泌、肺湿/干重比和肺组织促炎细胞因子的分泌,改善了肺组织形态。SFJDC增加了A2AAR的表达,并抑制了NF-κB的磷酸化。TUNEL染色和流式细胞术表明,SFJDC通过降低Cc3的表达和Bax/Bcl-2的比率来抑制细胞凋亡。结论:根据本研究的结果,SFJDC可以减少炎症并抑制细胞凋亡。A2AAR的激活和NF-κB表达的调节被认为是SFJDC抗炎和抗凋亡的原因。SFJDC的多种活性成分可能产生抗炎和解热作用。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
探索SFJDC是否能通过减轻炎症和细胞凋亡来改善LPS诱导的急性肺损伤,并阐明其潜在机制。
核心机制
SFJDC通过上调A2AAR表达,增加cAMP水平,抑制NF-κB磷酸化,从而减少炎症因子释放和细胞凋亡,发挥抗炎和抗凋亡作用。
主要证据
在LPS诱导的ALI小鼠模型中,SFJDC改善了肺组织形态,降低了TNF-α、IL-1β、IL-6水平及肺湿/干重比;在RAW264.7和A549细胞模型中,SFJDC通过A2AAR/cAMP/NF-κB通路抑制炎症和凋亡,Western blot、ELISA、TUNEL和流式细胞术均证实了这些变化。
研究意义
研究表明SFJDC可以抑制炎症反应和细胞凋亡来减轻ALI,提示其在ALI防治中具有潜在价值,并为COVID-19的临床用药提供参考依据。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

建立LPS诱导的ALI小鼠模型及SFJDC预防性给药

评估SFJDC对LPS诱导的急性肺损伤的保护作用

将C57/BL6J小鼠随机分为6组,分别给予不同剂量SFJDC(0.1、0.3、0.5 g/kg)或地塞米松连续灌胃7天,随后腹腔注射LPS(5 mg/kg)诱导ALI,12小时后处死取材。

2

评估SFJDC对LPS诱导的小鼠肺损伤的影响

验证SFJDC是否可以减轻LPS引起的肺组织损伤和炎症反应

通过HE染色观察肺组织形态,检测肺湿/干重比,并使用ELISA检测血清中TNF-α、IL-1β和IL-6水平。

3

确定SFJDC最佳体外实验浓度及对RAW264.7细胞活力的影响

筛选SFJDC的最佳处理浓度,并评估其细胞毒性

使用CCK-8试剂盒检测不同浓度SFJDC处理RAW264.7细胞后的活力,并检测不同浓度下炎症因子的表达。

4

验证SFJDC对RAW264.7细胞A2AAR表达的影响

探究SFJDC是否能通过调节A2AAR表达影响巨噬细胞炎症反应

使用RT-qPCR和免疫荧光染色检测SFJDC处理RAW264.7细胞后A2AAR的表达,并与A2AAR特异抑制剂ZM241385和激动剂CGS21680进行比较。

5

研究SFJDC对RAW264.7细胞A2A/cAMP/NF-κB信号通路的影响

阐明SFJDC调控炎症反应的潜在分子机制

通过Western blot检测RAW264.7细胞中A2AAR、PKA、IκB、p-IκB、P65、p-P65蛋白水平,并检测cAMP浓度。

6

验证SFJDC对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症的抑制作用

确认SFJDC在体外模型中能否抑制巨噬细胞炎症反应

使用ELISA检测RAW264.7细胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6水平,并通过Western blot检测相关信号通路蛋白。

7

评估SFJDC对LPS诱导的小鼠肺组织细胞凋亡的影响

评估SFJDC对体内LPS诱导的细胞凋亡的影响

通过TUNEL染色检测肺组织细胞凋亡,并使用Western blot检测凋亡相关蛋白表达。

8

研究SFJDC对巨噬细胞介导的肺上皮细胞凋亡的影响

探究SFJDC能否通过抑制巨噬细胞炎症反应来减少肺上皮细胞凋亡

将RAW264.7细胞培养上清液与A549细胞共培养,通过流式细胞术和Western blot检测A549细胞凋亡情况。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
疏风解毒胶囊Anhui Jiren Pharmaceutical Co., Ltd.3200509
地塞米松注射液Chenxin Pharmaceutical Co., Ltd.H37021969
脂多糖Sigma Biological CompanyL2880-10
ZM241385GLPBIO Biological Company--
CGS21680GLPBIO Biological Company--
DMEM培养基HyClone--
胎牛血清----
CCK-8试剂盒Bioss--
ELISA试剂盒(TNF-α、IL-6、IL-1β)Suzhou Calvin Biotechnology Co., Ltd.--
Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒Beibo Biological Co., Ltd--
RIPA裂解液EpiZyme--
BCA蛋白检测试剂盒Beyotime--
PVDF膜Bio-Rad--
超敏ECL化学发光试剂盒GlpBio--
TRIzol试剂Accurate Biology--
Evo M-MLV逆转录试剂盒Accurate Biology--
SYBR Green qPCR预混试剂盒Accurate Biology--
A2AAR抗体Bioss Biotech--
P65抗体Shenyang Wanlei Biological Company--
IκB抗体Shenyang Wanlei Biological Company--
p-IκB抗体Shenyang Wanlei Biological Company--
p-P65抗体Shenyang Wanlei Biological Company--
Cc3抗体Shenyang Wanlei Biological Company--
Bax抗体Affinity Biological Company--
Bcl-2抗体Affinity Biological Company--
PKA抗体Affinity Biological Company--
β-actin抗体Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co., Ltd--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
动物模型
小鼠品系:C57/BL6J,雄性,20-22 g,7 ± 1周龄;分组:对照组、LPS组、SFJDC 0.1/0.3/0.5 g/kg组、Dex 5 mg/kg组;每组6只。SFJDC灌胃7天;LPS 5 mg/kg腹腔注射,0.2 mL;造模后12小时取材。
阅读提示:Materials and methods,2.2 Animal models
细胞模型
RAW264.7细胞:SFJDC 0.5 mg/mL预处理1小时,LPS 1 μg/mL处理24小时;A549细胞:RAW264.7细胞上清液处理24小时。
阅读提示:Materials and methods,2.3 Cell culture and coculture
炎症因子检测
ELISA检测血清和细胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6含量。
阅读提示:Materials and methods,2.6 ELISA
信号通路检测
Western blot检测A2AAR、PKA、IκB、p-IκB、P65、p-P65蛋白表达;cAMP浓度测定。
阅读提示:Materials and methods,2.7 Determination of cAMP concentration,2.9 Western blot
凋亡检测
TUNEL染色检测肺组织凋亡;流式细胞术检测A549细胞凋亡;Western blot检测Cc3、Bax、Bcl-2蛋白。
阅读提示:Materials and methods,2.5 Histopathological and TUNEL staining,2.10 Flow cytometry and apoptosis,2.9 Western blot