建立LPS诱导的ALI小鼠模型及SFJDC预防性给药
评估SFJDC对LPS诱导的急性肺损伤的保护作用
将C57/BL6J小鼠随机分为6组,分别给予不同剂量SFJDC(0.1、0.3、0.5 g/kg)或地塞米松连续灌胃7天,随后腹腔注射LPS(5 mg/kg)诱导ALI,12小时后处死取材。
Shufeng Jiedu capsule inhibits inflammation and apoptosis by activating A2AAR and inhibiting NF-κB to alleviate LPS-induced ALI.
包含动物模型(LPS诱导ALI小鼠)和体外细胞模型(RAW264.7、A549),并结合Western blot、ELISA、流式细胞术、TUNEL、免疫荧光等多种方法进行功能与机制验证。
LPS诱导的ALI小鼠模型(C57/BL6J小鼠) RAW264.7小鼠单核巨噬细胞 A549人肺腺癌细胞
SFJDC给药剂量:0.1、0.3、0.5 g/kg,连续灌胃7天 LPS造模剂量:5 mg/kg,腹腔注射,0.2 mL RAW264.7细胞处理:SFJDC 0.5 mg/mL预处理1小时,LPS 1 μg/mL处理24小时 A549细胞与RAW264.7上清液共培养24小时 体内实验每组6只小鼠,体外实验每组3个重复
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估SFJDC对LPS诱导的急性肺损伤的保护作用
将C57/BL6J小鼠随机分为6组,分别给予不同剂量SFJDC(0.1、0.3、0.5 g/kg)或地塞米松连续灌胃7天,随后腹腔注射LPS(5 mg/kg)诱导ALI,12小时后处死取材。
验证SFJDC是否可以减轻LPS引起的肺组织损伤和炎症反应
通过HE染色观察肺组织形态,检测肺湿/干重比,并使用ELISA检测血清中TNF-α、IL-1β和IL-6水平。
筛选SFJDC的最佳处理浓度,并评估其细胞毒性
使用CCK-8试剂盒检测不同浓度SFJDC处理RAW264.7细胞后的活力,并检测不同浓度下炎症因子的表达。
探究SFJDC是否能通过调节A2AAR表达影响巨噬细胞炎症反应
使用RT-qPCR和免疫荧光染色检测SFJDC处理RAW264.7细胞后A2AAR的表达,并与A2AAR特异抑制剂ZM241385和激动剂CGS21680进行比较。
阐明SFJDC调控炎症反应的潜在分子机制
通过Western blot检测RAW264.7细胞中A2AAR、PKA、IκB、p-IκB、P65、p-P65蛋白水平,并检测cAMP浓度。
确认SFJDC在体外模型中能否抑制巨噬细胞炎症反应
使用ELISA检测RAW264.7细胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6水平,并通过Western blot检测相关信号通路蛋白。
评估SFJDC对体内LPS诱导的细胞凋亡的影响
通过TUNEL染色检测肺组织细胞凋亡,并使用Western blot检测凋亡相关蛋白表达。
探究SFJDC能否通过抑制巨噬细胞炎症反应来减少肺上皮细胞凋亡
将RAW264.7细胞培养上清液与A549细胞共培养,通过流式细胞术和Western blot检测A549细胞凋亡情况。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | 疏风解毒胶囊 | Anhui Jiren Pharmaceutical Co., Ltd. | 3200509 |
| 阳性对照药物 | 地塞米松注射液 | Chenxin Pharmaceutical Co., Ltd. | H37021969 |
| 炎症诱导 | 脂多糖 | Sigma Biological Company | L2880-10 |
| A2AAR抑制剂 | ZM241385 | GLPBIO Biological Company | -- |
| A2AAR激动剂 | CGS21680 | GLPBIO Biological Company | -- |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | HyClone | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂盒 | Bioss | -- |
| ELISA | ELISA试剂盒(TNF-α、IL-6、IL-1β) | Suzhou Calvin Biotechnology Co., Ltd. | -- |
| 凋亡检测 | Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒 | Beibo Biological Co., Ltd | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | EpiZyme | -- |
| BCA蛋白检测试剂盒 | Beyotime | -- | |
| PVDF膜 | Bio-Rad | -- | |
| 超敏ECL化学发光试剂盒 | GlpBio | -- | |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Accurate Biology | -- |
| Evo M-MLV逆转录试剂盒 | Accurate Biology | -- | |
| SYBR Green qPCR预混试剂盒 | Accurate Biology | -- | |
| 免疫荧光染色 | A2AAR抗体 | Bioss Biotech | -- |
| P65抗体 | Shenyang Wanlei Biological Company | -- | |
| Western blot | IκB抗体 | Shenyang Wanlei Biological Company | -- |
| p-IκB抗体 | Shenyang Wanlei Biological Company | -- | |
| p-P65抗体 | Shenyang Wanlei Biological Company | -- | |
| Cc3抗体 | Shenyang Wanlei Biological Company | -- | |
| Bax抗体 | Affinity Biological Company | -- | |
| Bcl-2抗体 | Affinity Biological Company | -- | |
| PKA抗体 | Affinity Biological Company | -- | |
| β-actin抗体 | Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co., Ltd | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型 | 小鼠品系:C57/BL6J,雄性,20-22 g,7 ± 1周龄;分组:对照组、LPS组、SFJDC 0.1/0.3/0.5 g/kg组、Dex 5 mg/kg组;每组6只。SFJDC灌胃7天;LPS 5 mg/kg腹腔注射,0.2 mL;造模后12小时取材。 阅读提示:Materials and methods,2.2 Animal models |
| 细胞模型 | RAW264.7细胞:SFJDC 0.5 mg/mL预处理1小时,LPS 1 μg/mL处理24小时;A549细胞:RAW264.7细胞上清液处理24小时。 阅读提示:Materials and methods,2.3 Cell culture and coculture |
| 炎症因子检测 | ELISA检测血清和细胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6含量。 阅读提示:Materials and methods,2.6 ELISA |
| 信号通路检测 | Western blot检测A2AAR、PKA、IκB、p-IκB、P65、p-P65蛋白表达;cAMP浓度测定。 阅读提示:Materials and methods,2.7 Determination of cAMP concentration,2.9 Western blot |
| 凋亡检测 | TUNEL染色检测肺组织凋亡;流式细胞术检测A549细胞凋亡;Western blot检测Cc3、Bax、Bcl-2蛋白。 阅读提示:Materials and methods,2.5 Histopathological and TUNEL staining,2.10 Flow cytometry and apoptosis,2.9 Western blot |