CIA大鼠模型构建及HQT药效评估
验证HQT对RA动物模型的治疗效果及其对miR-125b表达的影响。
使用CIA大鼠模型，设对照组、模型组、MTX组和三个HQT剂量组，给药30天，测量关节肿胀、血清TNF-α、IL-1β、IL-6和miR-125b水平。
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中药复方化瘀强身通痹汤通过上调miR-125b靶向CK2抑制NF-κB诱导的炎症来减轻类风湿关节炎
Chinese Herbal Formula Huayu-Qiangshen-Tongbi Decoction Attenuates Rheumatoid Arthritis through Upregulating miR-125b to Suppress NF-κB-Induced Inflammation by Targeting CK2.
实验完整度
高包含体内CIA大鼠模型、体外LPS诱导MH7A细胞模型，以及双荧光素酶报告基因、Western blot、ELISA、qRT-PCR等功能验证和机制验证。
主要模型
LPS处理的人风湿性成纤维样滑膜细胞MH7A细胞 胶原诱导性关节炎（CIA）大鼠模型
重点核对
CIA大鼠模型：Wistar大鼠，6-8周龄，分为6组（n=8），包括对照组、模型组、MTX（1mg/kg）、HQT低（9.4g/kg）、中（18.8g/kg）、高（37.6g/kg）剂量组 LPS诱导炎症模型：MH7A细胞先用0.1mg/mL HQT预处理2小时，再暴露于1μg/mL LPS 24小时 细胞转染：miR-125b mimics、miR-125b inhibitor及其阴性对照转染MH7A细胞48小时 NF-κB抑制剂PDTC（S3633）处理 IκB-α过表达（pcDNA-IκB-α转染）
摘要
化瘀强身通痹汤（HQT）是一种中药复方，已被证明对类风湿关节炎（RA）具有有效的治疗作用。然而，HQT在RA中的具体分子机制尚未得到充分研究。在本研究中，采用脂多糖（LPS）处理的人风湿性成纤维样滑膜细胞（FLS）MH7A细胞和胶原诱导性关节炎（CIA）小鼠作为体外和体内模型。我们的结果表明，HQT能够通过减少包括肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）和白介素-6（IL-6）在内的细胞因子的产生，有效抑制RA诱导的炎症。此外，HQT显著上调了miR-125b的表达。此外，生物信息学分析提示酪蛋白激酶2（CK2）是miR-125b的潜在靶点。进行了荧光素酶报告基因实验，结果表明miR-125b在MH7A细胞中抑制了CK2的表达。此外，miR-125b抑制了LPS诱导的NF-κB活化，NF-κB是CK2的下游靶点。另外，NF-κB抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸铵（PDTC）和NF-κB抑制因子α（IκB-α）增强了miR-125b对TNF-α、IL-1β和IL-6表达的抑制作用。总之，我们的研究揭示了HQT通过上调miR-125b靶向CK2抑制NF-κB诱导的炎症来减轻RA。本研究的结果应有助于研究HQT治疗RA的机制，并发现RA的新治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 研究HQT复方减轻类风湿关节炎的具体分子机制。
- 核心机制
- HQT通过上调miR-125b，靶向抑制CK2表达，进而抑制NF-κB信号通路的激活，减少炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的产生。
- 主要证据
- 体内实验显示HQT降低CIA大鼠血清炎症因子并上调miR-125b；体外实验表明miR-125b直接靶向CK2（双荧光素酶报告基因），且miR-125b抑制LPS诱导的NF-κB活化，PDTC和IκB-α增强其抗炎作用。
- 研究意义
- 本研究揭示了HQT治疗RA的机制，有助于发现RA的新治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
双荧光素酶报告基因验证CK2为miR-125b靶点
验证CK2是否为miR-125b的直接靶基因。
将含CK2 3'UTR野生型（WT）或突变型（MUT）的荧光素酶报告质粒与miR-125b mimics或inhibitor共转染MH7A细胞，检测荧光素酶活性。
miR-125b对LPS诱导MH7A细胞NF-κB通路及炎症因子的影响
验证miR-125b是否通过CK2抑制NF-κB活化并减少炎症因子产生。
用LPS处理转染miR-125b mimics或inhibitor的MH7A细胞，检测CK2表达、NF-κB通路蛋白（p-p65, p-IκB-α）及炎症因子水平。
验证NF-κB抑制剂PDTC和IκB-α过表达增强miR-125b的抗炎作用
证实NF-κB通路在miR-125b抗炎作用中的关键性。
在LPS处理的MH7A细胞中，用PDTC处理或过表达IκB-α（pcDNA-IκB-α），检测NF-κB活化及炎症因子水平。
验证HQT通过上调miR-125b抑制NF-κB炎症通路
验证HQT在体外是否通过miR-125b/CK2/NF-κB轴发挥抗炎作用。
用0.1mg/mL HQT预处理LPS诱导的MH7A细胞，检测miR-125b、pre-miR-125b、pri-miR-125b、CK2、NF-κB通路及炎症因子；并用miR-125b inhibitor和PDTC干预。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
验证机制链路
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | -- | |
| 药物处理 | 脂多糖 | Sigma | L2880 |
| 细胞转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| miR-125b模拟物 | GenePharma | -- | |
| miR-125b抑制剂 | GenePharma | -- | |
| 细胞增殖检测 | CCK-8试剂盒 | Dojindo | -- |
| 双荧光素酶报告基因实验 | pmirGLO荧光素酶报告载体 | Promega | -- |
| 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | -- | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| RT-qPCR | PrimeScript II第一链cDNA合成试剂盒 | Takara Bio | -- |
| SYBR Premix Ex Taq II | Takara Bio | -- | |
| 7500 Fast实时荧光定量PCR仪 | Applied Biosystems | -- | |
| miScript SYBR-Green PCR试剂盒 | -- | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 抗p-p65抗体 | Bioss | bs-5660R | |
| 抗p-IκB-α抗体 | Bioss | bs-3191R | |
| 抗GAPDH抗体 | Aksomics | KC-5G5 | |
| HRP标记的二抗 | -- | -- | |
| Amersham ECL试剂盒 | GE Healthcare | -- | |
| ELISA | 大鼠TNF-α ELISA试剂盒 | 北京冬歌博业生物科技有限公司 | DG20065D |
| 小鼠IL-1β ELISA试剂盒 | 北京冬歌博业生物科技有限公司 | DG94484Q | |
| 小鼠IL-6 ELISA试剂盒 | 北京冬歌博业生物科技有限公司 | DG94490Q | |
| 人CK2 ELISA试剂盒 | 北京冬歌博业生物科技有限公司 | DG95793Q | |
| 人TNF-α ELISA试剂盒 | 北京冬歌博业生物科技有限公司 | DG10053H | |
| 人IL-1β ELISA试剂盒 | 北京冬歌博业生物科技有限公司 | DG10307H | |
| 人IL-6 ELISA试剂盒 | 北京冬歌博业生物科技有限公司 | DG10306H | |
| 动物实验 | 牛II型胶原 | Chondrex | -- |
| 不完全弗氏佐剂 | Chondrex | -- | |
| Wistar大鼠 | 北京维通利华实验动物技术有限公司 | -- | |
| 细胞培养 | MH7A细胞 | ATCC | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| CIA大鼠模型 | 大鼠品系（Wistar）、性别（雄性）、年龄（6-8周）、分组（对照组、模型组、MTX组、HQT低/中/高剂量组）、每组样本量（n=8）、胶原剂量（100μg）、免疫方式（尾基部皮下注射）、给药方式（灌胃）、给药剂量（MTX 1mg/kg，HQT 9.4/18.8/37.6 g/kg）、给药时间（30天） 阅读提示：Methods 2.1 |
| LPS诱导炎症细胞模型 | MH7A细胞系、LPS浓度（1μg/mL）、HQT预处理浓度（0.1mg/mL）、预处理时间（2小时）、处理时间（24小时） 阅读提示：Methods 2.3 |
| 细胞转染 | 转染试剂（Lipofectamine 2000）、转染时间（48小时）、miR-125b mimics/inhibitor浓度（未明确） 阅读提示：Methods 2.4 |
| 双荧光素酶报告基因实验 | 报告质粒（pmirGLO）、共转染的miR-125b mimics/inhibitor浓度（未明确）、转染时间（48小时） 阅读提示：Methods 2.6 |
| Western blot | 一抗稀释比例（anti-p-p65 1:500, anti-p-IκB-α 1:500, anti-GAPDH 1:10000）、二抗孵育时间（1小时）、封闭时间（5分钟）、蛋白上样量（未明确） 阅读提示：Methods 2.8 |
| ELISA | 检测的细胞因子种类（TNF-α, IL-1β, IL-6, CK2）、样本类型（血清或细胞上清）、试剂盒品牌（北京冬歌博业） 阅读提示：Methods 2.9 |