构建FAdV-4蛋白-宿主蛋白相互作用网络
鉴定与FAdV-4主要结构蛋白相互作用的宿主蛋白
通过LC-MS/MS分析，鉴定与Hexon、Fiber 1、Fiber 2和Penton base相互作用的宿主蛋白，并构建PPI网络。
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Hsp70在DnaJC7的辅助下通过抑制病毒Hexon蛋白来抑制禽腺病毒血清4型的复制
Hsp70 Inhibits the Replication of Fowl Adenovirus Serotype 4 by Suppressing Viral Hexon with the Assistance of DnaJC7.
实验完整度
高包含LC-MS/MS互作组筛选、过表达/沉默功能验证、截短体结构域分析、Co-IP和GST pulldown机制验证、自噬抑制剂实验等独立证据层级。
主要模型
LMH细胞（鸡肝癌细胞系） HEK293T细胞（人胚肾细胞系） FAdV-4 JS株感染模型
重点核对
细胞系: LMH和HEK293T 病毒株: FAdV-4 JS株 感染剂量: MOI=0.01 时间点: 24和48 hpi 处理浓度: CHX和CQ均为10 μM
摘要
禽腺病毒血清4型(FAdV-4)感染会导致肉鸡发生严重的肝炎-心包积水综合征(HHS)，给家禽业造成巨大的经济损失；然而，宿主对FAdV-4的特异性反应仍然未知。在本研究中，我们通过液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析，鉴定了病毒主要蛋白(Hexon、Fiber 1、Fiber 2和Penton base)与宿主蛋白之间的141个高置信度蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)。我们发现热休克蛋白70 (Hsp70)（评分最高的蛋白）及其辅因子DnaJ热休克蛋白40家族成员C7 (DnaJC7)能够负向调节FAdV-4的复制。此外，Hsp70的核苷酸结合域(NBD)和DnaJC7的J结构域是抑制FAdV-4复制所必需的。我们验证了DnaJC7作为桥梁可以结合Hsp70和Hexon，协助Hsp70与Hexon之间的间接相互作用。另外，我们发现FAdV-4感染以剂量依赖性方式强烈诱导自噬蛋白和细胞Hsp70的表达。当自噬途径被特异性抑制剂氯喹(CQ)阻断时，Hsp70过表达对Hexon的阻断显著减少。我们的结果表明，Hsp70被DnaJC7协同作用与病毒Hexon相互作用，并通过自噬途径抑制Hexon，从而显著限制FAdV-4的复制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 宿主蛋白Hsp70及其辅因子DnaJC7在FAdV-4感染中如何调控病毒复制及其分子机制？
- 核心机制
- DnaJC7作为桥梁蛋白，协助Hsp70与病毒Hexon蛋白间接相互作用，并通过自噬途径促进Hexon降解，从而抑制FAdV-4复制。
- 主要证据
- LC-MS/MS鉴定相互作用；过表达Hsp70和DnaJC7降低病毒Hexon水平和病毒滴度；沉默两者增加病毒复制；Co-IP和GST pulldown证实相互作用；自噬抑制剂CQ逆转Hsp70对Hexon的抑制。
- 研究意义
- 首次揭示Hsp70-DnaJC7分子伴侣复合物在FAdV-4感染中的抗病毒作用，为靶向Hsp70、DnaJC7与Hexon相互作用开发抗FAdV-4药物提供新策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证Hsp70和DnaJC7对FAdV-4复制的影响
确定Hsp70和DnaJC7是否调控FAdV-4复制
过表达或敲低Hsp70和DnaJC7，检测病毒Hexon蛋白水平和病毒滴度。
鉴定Hsp70和DnaJC7的功能结构域
确定抑制FAdV-4复制所需的关键结构域
过表达Hsp70或DnaJC7的不同截短体，检测病毒Hexon蛋白和病毒滴度。
分析Hsp70、DnaJC7和Hexon之间的相互作用
验证三种蛋白是否相互作用及其结合方式
Co-IP和GST pulldown实验检测相互作用，并通过共聚焦显微镜观察共定位。
验证Hsp70抑制Hexon的自噬途径
探究Hsp70抑制Hexon的降解途径
检测FAdV-4感染后自噬标志蛋白表达；使用放线菌酮追踪Hexon蛋白降解；使用自噬抑制剂CQ、MG132处理，检测Hexon蛋白水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 高糖DMEM培养基 | HyClone | SH30022 |
| 胎牛血清 | Gibco | 1009-141C | |
| 质粒构建 | ClonExpress II一步克隆试剂盒 | Vazyme | C112 |
| 基因沉默 | siHsp70 | -- | -- |
| siDnaJC7 | -- | -- | |
| 药物处理 | 氯喹 | MedChemExpress | HY-17589A |
| MG132 | MedChemExpress | HY-13259 | |
| 转染 | jetPRIME转染试剂 | Polyplus Transfection | PT114-15 |
| 免疫沉淀 | Protein A/G Plus琼脂糖 | Santa Cruz Animal Health | SC-2003 |
| GST pull-down | 谷胱甘肽磁珠 | GenScript | L00206 |
| 抗体 | 抗Hsp70抗体 | Abcam | AB5439 |
| 抗LC3-II抗体 | Abcam | AB192890 | |
| 抗DnaJC7抗体 | Bioss | BS-8280R | |
| 抗GST抗体 | ABclonal Technology | AE006 | |
| 抗myc标签抗体 | Huaan Biotechnology | R1208-1 | |
| 抗Flag抗体 | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| 抗ULK1抗体 | Santa Cruz Animal Health | sc390904 | |
| 抗ATG16抗体 | Santa Cruz Animal Health | sc393274 | |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂盒 | Zeta Life | K009-100 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 感染模型的建立 | 细胞系为LMH；病毒株为FAdV-4 JS株；感染剂量MOI=0.01；感染时间24或48小时 阅读提示：Materials and Methods部分“Viruses and cells”和“Overexpression of host proteins and viral titers” |
| 过表达与基因沉默 | 转染质粒或siRNA的种类和量：质粒为0.8 μg，siRNA为40 pmol；转染试剂为jetPRIME 阅读提示：Materials and Methods部分“Plasmid construction”、“Overexpression of host proteins and viral titers”和“Gene silencing using siRNA” |
| 关键试剂处理 | CHX和CQ浓度均为10 μM；处理时间：CHX处理0-5小时，CQ处理6小时 阅读提示：Figure 8图注及Materials and Methods相关试剂信息 |
| 病毒滴度检测 | 使用TCID50方法测定病毒滴度；采用Reed Muench方法计算 阅读提示：Materials and Methods部分“Overexpression of host proteins and viral titers” |
| 蛋白互作验证 | Co-IP使用抗Flag抗体和Protein A/G Plus Agarose；GST pulldown使用Glutathione Magbeads 阅读提示：Materials and Methods部分“Co-immunoprecipitation assays and mass spectrometry”和“GST pulldown assay” |