装载在藻酸盐敷料中的小鼠巨噬细胞或其分泌组可增强糖尿病小鼠受损创面的愈合

Murine macrophages or their secretome delivered in alginate dressings enhance impaired wound healing in diabetic mice.

作者信息Georgios Theocharidis, Sahar Rahmani, Sangmin Lee, Zhuqing Li, Antonio Lobao, Konstantinos Kounas, Xanthi-Lida Katopodi, Peng Wang, Salina Moon, Ioannis S Vlachos, Monika Niewczas, David Mooney, Aristidis Veves
PMID35934520
发布时间2022-09
DOI10.1016/j.biomaterials.2022.121692

实验完整度

包含体外巨噬细胞极化表征、细胞/条件培养基负载敷料制备、16天及10天糖尿病小鼠伤口模型、组织学、免疫荧光、RNA-seq和蛋白质组学多层级验证。

主要模型

原代小鼠骨髓来源巨噬细胞(M0、M1、M2a、M2c) RAW 264.7巨噬细胞系 db/db糖尿病小鼠伤口模型

重点核对

细胞负载密度:每张敷料1×10^6个细胞,预期保留50% 处理分组:Ctrl、M0、M1、M2a、M2c(细胞或条件培养基) 伤口模型:16周龄雄性db/db小鼠背部两个6mm全层皮肤伤口 敷料更换时间:第3天更换一次,共两次 检测终点:第10天或第16天伤口闭合率

摘要

糖尿病足溃疡是一种毁灭性的糖尿病并发症,存在未满足的需求。我们探讨了钙交联藻酸盐敷料在向糖尿病创面局部递送原代巨噬细胞及其分泌组方面的功效。藻酸盐绷带具有微孔结构,能够实现均匀的细胞负载,并在伤口放置后延长细胞存活和迁出。体外实验表明,我们能够成功地将原代小鼠骨髓来源的单核细胞分化并极化为具有不同基因表达、表面蛋白和分泌组特征的M0、M1、M2a和M2c定义状态。原代巨噬细胞在绷带中递送,在伤口内迁移,并在损伤后长达16天仍存在。在db/db小鼠的伤口中,与对照组相比,所有巨噬细胞亚型及其分泌组治疗均加速了伤口愈合。伤口裂解物的批量RNA测序分析和多重蛋白定量显示,M2c巨噬细胞条件培养基对伤口愈合影响最大,影响神经发生等过程,而M1条件培养基促进角化和表皮分化。总的来说,我们的结果表明,藻酸盐敷料可作为糖尿病伤口局部治疗的递送平台,且来自不同极化巨噬细胞的条件培养基在促进伤口愈合方面与其亲本细胞同等或更有效,因此可能成为细胞治疗的一种有前景且技术上有利的替代方案。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
藻酸盐敷料能否作为递送平台,局部应用巨噬细胞或其分泌组,并评估其对糖尿病小鼠伤口愈合的影响
核心机制
M2c条件培养基通过促进神经发生相关过程,M1条件培养基通过促进角化和表皮分化来加速伤口愈合
主要证据
在db/db小鼠伤口模型中,所有巨噬细胞亚型和条件培养基均加速愈合;RNA-seq显示CM1和CMC处理激活不同生物学过程;蛋白组学显示CMC处理伤口中GCSF、MMP3和可溶性PECAM-1水平降低
研究意义
巨噬细胞条件培养基可作为细胞治疗的替代方案,用于治疗非愈合性慢性糖尿病足溃疡

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

藻酸盐敷料制备与细胞负载优化

制备具有微孔结构的钙交联藻酸盐敷料,并优化细胞负载方法

通过冻干、钙交联和二次冻干制备敷料,表征孔隙率和溶胀率,使用RAW264.7细胞优化负载体积和密度,检测细胞活力、增殖和分布

2

原代巨噬细胞分化与极化表征

从骨髓单核细胞分化并极化为M0、M1、M2a和M2c巨噬细胞,并验证其表型

从小鼠骨髓分离单核细胞,用M-CSF、LPS/IFNγ、IL-4/IL-13、IL-10极化,通过多重细胞因子检测、qRT-PCR和流式细胞术表征

3

体内递送细胞或条件培养基至糖尿病伤口

评估藻酸盐敷料负载细胞或条件培养基对糖尿病小鼠伤口愈合的影响

在db/db小鼠背部制造6mm全层皮肤伤口,敷料负载细胞或条件培养基,分别于第3天更换,第16天或第10天分析伤口闭合、细胞浸润和极化

4

转录组和蛋白质组分析

探究不同条件培养基处理对伤口基因表达和蛋白质谱的影响,揭示作用机制

对第10天伤口组织进行bulk RNA-seq和Luminex蛋白定量分析,比较CM1、CMC与对照组差异表达基因和蛋白变化

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
MVG藻酸盐NovaMatrix--
RPMI 1640培养基ThermoFisher22400105
胎牛血清MilliporeSigmaF4135
巨噬细胞集落刺激因子Peprotech315-02
脂多糖SigmaL4391
干扰素γPeprotech315-05
白细胞介素-4Peprotech214-14
白细胞介素-13Peprotech210-13
白细胞介素-10Peprotech210-10
CD11b抗体Biolegend101255
F4/80抗体Biolegend123117
CD86抗体Biolegend105109
CD369抗体Biolegend144305
CD301b (MGL2)抗体Biolegend146809
CD163抗体BiossBS-2527R-PE
抗CD3抗体Abcamab16669
抗NIMP-R14抗体Santa Cruz Biotechnologysc-59338
抗F4/80抗体Abcamab6640
抗CD11b抗体Abcamab133357
抗iNOS抗体ThermoFisherma3-030
抗YM1抗体R&D SystemsAF2446
抗CD68抗体Abcamab125212
抗CD206抗体Santa Cruz Biotechnologysc-58987
抗TNFα抗体R&D SystemsAF410NA
抗αSMA抗体Abcamab5694
抗Ki67抗体Abcamab15580
抗RFP抗体ChromotekABIN334653
抗CD31抗体Abcamab28364
Milliplex小鼠细胞因子/趋化因子32重检测板Millipore SigmaMCYTMAG-70K-PMX
TGFB 3重检测板Millipore SigmaTGFBMAG-64K-03
MMP 5重检测板Millipore SigmaMMMP3MAG-79K
血管生成27重检测板Millipore SigmaMAGPMAG-24K

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
藻酸盐敷料制备
藻酸盐浓度2%(w/v),冻干和钙交联步骤,负载体积50μl
阅读提示:Materials and methods 4.2
巨噬细胞极化和表征
极化细胞因子浓度(M1: LPS 100ng/mL, IFNγ 200ng/mL; M2a: IL-4 80ng/mL, IL-13 40ng/mL; M2c: IL-10 80ng/mL),处理时间24小时
阅读提示:Materials and methods 4.6
动物模型与伤口处理
16周龄雄性db/db小鼠,两个6mm全层皮肤伤口,敷料在第3天更换
阅读提示:Materials and methods 4.9
条件培养基制备与加载
条件培养基浓缩约13倍,加载体积50μl
阅读提示:Materials and methods 4.8
数据分析
RNA-seq差异表达基因阈值(log2FC≥1,FDR≤0.05)
阅读提示:Materials and methods 4.13