临床样本相关性分析
评估MHC-I与pSer616 DRP-1表达水平及其与患者预后的关联
对HNSCC、NSCLC和黑色素瘤患者的肿瘤样本进行MHC-I和pSer616 DRP-1的免疫荧光和免疫组化染色，并进行Spearman相关分析和Kaplan-Meier生存分析。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
线粒体分裂通过降低MHC-I表面表达诱导实体瘤免疫逃逸
Mitochondrial fission induces immunoescape in solid tumors through decreasing MHC-I surface expression.
实验完整度
高包含临床样本相关性分析、体外细胞实验、同基因小鼠模型、PDX模型及机制验证（ChIP、荧光素酶报告基因）等至少两个独立证据层级，并明确功能验证。
主要模型
头颈鳞癌（HNSCC）、非小细胞肺癌（NSCLC）和黑色素瘤患者肿瘤样本 舌鳞状细胞癌细胞系SCC-9和CAL-27 B16F10黑色素瘤同基因小鼠模型 HNSCC和NSCLC患者来源异种移植瘤（PDX）模型
重点核对
患者肿瘤样本中MHC-I与pSer616 DRP-1的表达相关性及生存分析（HNSCC 127例、NSCLC 62例、黑色素瘤59例） Mdivi-1处理剂量（2.5 mg/kg，尾静脉注射，每日一次，5天/7天周期）对B16F10同基因肿瘤模型的影响 PDX模型中ACT与Mdivi-1联合治疗对肿瘤生长和MHC-I表达的影响 Mdivi-1或DRP-1 siRNA处理对SCC-9和CAL-27细胞MHC-I表面表达及IRE1α-XBP-1s通路的影响 XBP-1s直接结合TPP2启动子并通过ChIP和荧光素酶报告基因验证的机制
摘要
癌细胞下调主要组织相容性复合体I类（MHC-I）的表面表达以进行免疫逃逸。在这里，作者表明快速的线粒体分裂激活内质网应激反应，导致实体癌细胞中MHC-I复合物形成和细胞表面表达减少；此外，抑制线粒体分裂可增强小鼠模型中的免疫介导的抗癌反应。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 线粒体分裂是否通过调控MHC-I表达影响实体瘤的免疫逃逸？
- 核心机制
- 线粒体分裂激活IRE1α-XBP-1s通路，XBP-1s转录激活氨基肽酶TPP2，TPP2降解肿瘤抗原肽，从而减少MHC-I三分子复合物的表面表达，导致免疫逃逸。
- 主要证据
- 临床样本显示pSer616 DRP-1与MHC-I负相关；Mdivi-1抑制线粒体分裂上调MHC-I并增强抗肿瘤免疫；机制实验证明XBP-1s直接调控TPP2，TPP2敲低增强MHC-I表达及T细胞杀伤。
- 研究意义
- 线粒体分裂抑制剂可能作为增强T细胞免疫治疗疗效的潜在策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
同基因小鼠模型验证
验证抑制线粒体分裂对MHC-I表达和抗肿瘤免疫的影响
使用B16F10-OVA细胞皮下或尾静脉注射C57BL/6小鼠，给予Mdivi-1或DMSO处理，检测肿瘤生长、转移、MHC-I表达、T细胞浸润和生存期，并在Rag1-/-小鼠中验证免疫依赖性。
PDX模型联合ACT评估
评估Mdivi-1联合过继T细胞治疗在患者来源异种移植瘤中的疗效
将HNSCC和NSCLC PDX植入NOD/SCID小鼠，给予ACT和Mdivi-1或DMSO，监测肿瘤生长、MHC-I表达、T细胞浸润和凋亡。
体外细胞功能验证
验证Mdivi-1对MHC-I表达和T细胞杀伤功能的影响
用Mdivi-1处理原代癌细胞，与自体T细胞共培养，检测癌细胞凋亡、Th1细胞因子和残余E/T比，并使用抗MHC-I抗体阻断和FO-1细胞系验证MHC-I依赖性。
机制研究：IRE1α-XBP-1s-TPP2轴
阐明线粒体分裂调控MHC-I表达的分子机制
通过DRP-1敲低/过表达、UPR分支干扰、转录组分析、ChIP和荧光素酶报告基因等方法，鉴定XBP-1s直接靶向TPP2，并验证TPP2对MHC-I表达的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证机制链路
评估体内效果
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Thermo Scientific | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 药物处理 | Mdivi-1 | MedChemExpress | HY-15886 |
| 细胞培养 | OVA慢病毒 | Addgene | 113030 |
| 细胞分离 | EasySep™人T细胞分离试剂盒 | Stemcell | 17951 |
| EpCAM+磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-061-101 | |
| SepMate™管 | Stemcell | 86450 | |
| 细胞因子处理 | 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 | PeproTech | -- |
| 白细胞介素-4 | PeproTech | -- | |
| 脂多糖 | Sigma | -- | |
| 干扰素-γ | PeproTech | -- | |
| 白细胞介素-2 | PeproTech | -- | |
| 功能检测 | IFN-γ中和抗体 | Thermo Fisher Scientific | 86450 |
| 凋亡检测 | 原位细胞死亡检测试剂盒 | Roche | 11684817910 |
| 免疫荧光 | 抗人EpCAM抗体 | Abcam | ab213500 |
| Alexa Fluor 594偶联二抗 | Thermo Fisher Scientific | A-11012 | |
| 显微镜成像 | Axio Imager A2显微镜 | ZEISS | -- |
| ELISpot | IFN-γ ELISpot试剂盒 | Dakewe | 2210001 and 211001 |
| 凋亡检测 | Annexin V和PI凋亡检测试剂盒 | eBioscience | 88-8007-74 |
| ELISA | IFN-γ ELISA试剂盒 | Raybiotech | ELH-IFNg-1 |
| IL-2 ELISA试剂盒 | Raybiotech | ELH-IL-2-1 | |
| TNF-α ELISA试剂盒 | Raybiotech | ELH-TNFa-1 | |
| 阻断实验 | 抗MHC-I单克隆抗体W6/32 | Santa Cruz | sc-32235 |
| 线粒体染色 | MitoTracker Red CMXRos线粒体染料 | Thermo Fisher | M7512 |
| 氧化应激检测 | 10-N-壬基吖啶橙 | Thermo Fisher | A1372 |
| 2',7'-二氯荧光素二乙酸酯 | Beyotime Biotechnology | S0033 | |
| 线粒体膜电位检测 | MitoScreen（JC-1）试剂盒 | BD Pharmingen | 551302 |
| 药物处理 | BAY-87-2243 | Bayer Pharma AG | -- |
| N-乙酰半胱氨酸 | Sigma | A7250 | |
| mitoTEMPO | Sigma | SML0737 | |
| T细胞分离 | CD8a+T细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-104-075 |
| T细胞激活 | 抗CD3/CD28磁珠 | Thermo Fisher | 11452D |
| 转染 | shTpp2 | Genechem | -- |
| OVA质粒 | Generay | -- | |
| SIINFEKL质粒 | Addgene | 102944 | |
| ELISA | 小鼠IFN-γ ELISA试剂盒 | Raybiotech | ELM-IFNg-1 |
| ChIP | 蛋白A琼脂糖 | Roche | -- |
| QIAquick PCR纯化试剂盒 | Qiagen | -- | |
| 抗XBP-1抗体 | Santa Cruz | sc-8015 | |
| 抗RNA聚合酶II抗体 | Abcam | ab5131 | |
| 荧光素酶报告基因 | pGL4.20-Basic载体 | Promega | -- |
| 双荧光素酶报告基因检测试剂盒 | Promega | -- | |
| 流式分析 | H-2Kb-FITC抗体 | JPT | MHC2163 |
| SIINFEKL-H-2Kb-FITC抗体 | Invitrogen | MA5-17999 | |
| 抗小鼠CD8a-APC抗体 | BD Pharmingen | 553035 | |
| 抗OVA-H-2Kb四聚体-BV421 | MBL | TB-5001-4 | |
| HLA-ABC-PE抗体 | BD Pharmingen | 560168 | |
| 穿孔素-BV421抗体 | BD Pharmingen | 563393 | |
| 颗粒酶B-FITC抗体 | BD Pharmingen | 560211 | |
| CD8-PE-CF594抗体 | BD Pharmingen | 562282 | |
| EpCAM-BV510抗体 | BD Pharmingen | 563181 | |
| ITGB1-PE抗体 | BD Pharmingen | 555443 | |
| TfR1-APC抗体 | BD Pharmingen | 561940 | |
| E-钙黏蛋白-BV421抗体 | BD Pharmingen | 743712 | |
| CD80-PE抗体 | BD Pharmingen | 560925 | |
| CD83-BV421抗体 | BD Pharmingen | 562630 | |
| CD86-FITC抗体 | BD Pharmingen | 560958 | |
| Annexin V-APC和7-AAD | BioLegend | 640930 | |
| FACSVerse流式细胞仪 | BD | -- | |
| FlowJo v10.4.0软件 | -- | -- | |
| qRT-PCR | SYBR Green实时PCR预混液 | Toyobo | -- |
| LightCycler 480实时荧光定量PCR仪 | Roche | -- | |
| 免疫印迹 | 抗MHC-I抗体 | Santa Cruz | sc-32235 |
| 抗IRE1α抗体 | Cell Signaling Technology | 3294 | |
| 抗磷酸化IRE1α抗体 | Novus Biologicals | NB100-2323 | |
| 抗XBP-1抗体 | Abcam | ab37151 | |
| 抗XBP-1s抗体 | BioLegend | 619502 | |
| 抗GRP78抗体 | Cell Signaling Technology | 3177 | |
| 抗CHOP抗体 | Cell Signaling Technology | 2895 | |
| 抗DRP-1抗体 | Cell Signaling Technology | 14647 | |
| 抗TPP2抗体 | Proteintech | 66017-1-Ig | |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Proteintech | 20536-1-AP | |
| 过氧化物酶偶联二抗 | Proteintech | SA00001-1, SA00001-2 | |
| 免疫荧光/免疫组化 | 抗pSer616 DRP-1抗体 | Bioss | bs-12702R-HRP |
| 免疫荧光 | 抗pSer616 DRP-1抗体 | Cell Signaling Technology | 4494 |
| 抗CD8抗体 | Abcam | ab93278 | |
| 免疫组化 | 抗CD4抗体 | Cell Signaling Technology | 25229s |
| 抗NK1.1抗体 | Wanleibio | WLH4257 | |
| 抗CD25抗体 | Affinity | AF7675 | |
| 抗CD206抗体 | Proteintech | 60143-1-Ig | |
| 抗CD20抗体 | Bioss | bs-0080R | |
| mRNA谱分析 | 安捷伦-026652全人基因组微阵列 | Agilent | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 临床样本分析 | 患者肿瘤样本类型（HNSCC、NSCLC、黑色素瘤）及数量（127例、62例、59例）；MHC-I和pSer616 DRP-1的检测方法（IF、IHC）；评分标准；生存分析方法（Kaplan-Meier, log-rank） 阅读提示：Methods: Patients and tissue samples; Figure 1 |
| 同基因小鼠模型 | 小鼠品系（C57BL/6）和性别（雌性）；周龄（5-6周）；细胞数量（2×10^5）；注射途径（皮下/尾静脉）；Mdivi-1剂量（2.5 mg/kg）和给药方案（尾静脉注射，每日一次，5天/7天周期）；对照组（DMSO）；肿瘤体积测量时间点；终点（直径15mm） 阅读提示：Methods: Syngeneic models; Figure 2 |
| PDX模型与ACT | PDX建立成功率（HNSCC 11/63, NSCLC 6/32）；小鼠品系（NOD/SCID）和周龄（4周）；T细胞和DC数量（2.5×10^6 T细胞，0.5×10^6 DCs）；ACT途径（尾静脉）；Mdivi-1剂量（2.5 mg/kg）和给药时间（与ACT同一天开始） 阅读提示：Methods: Patient-derived xenograft (PDX) implantation; Adoptive cell therapy (ACT); Figure 3 |
| 体外共培养实验 | 癌细胞处理（Mdivi-1 50 μM, 72小时）；E/T比（5:1等）；共培养时间（12小时凋亡检测，24小时细胞因子检测，3天残余E/T比检测）；抗MHC-I阻断抗体W6/32浓度（10 μg/mL）和孵育时间（2小时） 阅读提示：Methods: Cytotoxic and coculture assays; Figure 4 |
| 机制研究 | 细胞系（SCC-9, CAL-27）；DRP-1 siRNA或Mdivi-1处理条件；UPR分支干扰（DN IRE1α, XBP-1s siRNA/过表达）；ROS调节剂（NAC 5 mM, mitoTEMPO 10 μM, BAY-87-2243 10 nM）浓度和处理时间；微阵列分析条件（CAL-27 shXBP-1s vs 对照）；ChIP实验条件（抗体、qPCR引物）；荧光素酶报告基因实验（TPP2启动子片段） 阅读提示：Methods: Cell lines; Measurements of oxidative stress; Bioinformatic analysis; Chromatin immunoprecipitation assays; Luciferase reporter assay; Figure 5-7 |