细胞外基质相关蛋白在正常和隐睾子午岭黑山羊睾丸中的分布

Distribution of extracellular matrix related proteins in normal and cryptorchid ziwuling black goat testes.

作者信息Hua Wang, Ligang Yuan, Juanjuan Song, Qianmei Wang, Yong Zhang
PMID35712443
发布时间2022-06-01
DOI10.1590/1984-3143-AR2022-0005

实验完整度

包含组织化学、免疫组化、免疫荧光、Western blot及统计比较,验证了ECM蛋白在正常和隐睾睾丸中的分布差异。

主要模型

子午岭黑山羊正常睾丸 子午岭黑山羊隐睾睾丸

重点核对

正常和隐睾睾丸样本各6例,取自5月龄子午岭黑山羊 组织化学染色包括H&E、Masson、Gomori银氨、AB (pH=2.5)、PAS、AB-PAS 免疫组化使用anti-Col IV, anti-LN, anti-HSPG抗体(浓度0.33*10-2mg/ml) Western blot使用anti-Col IV, anti-LN, anti-HSPG抗体(浓度0.01*10-2mg/ml) 统计分析:随机选5张切片,每张6个视野,p<0.05为显著差异

摘要

子午岭黑山羊是中国本土品种,其后代常患有先天性隐睾。细胞外基质(ECM)含有调节睾丸发育的细胞因子和生长因子,其成分变化常导致病理变化。隐睾与ECM的结构变化密切相关。本研究采用组织化学染色、免疫组织化学、免疫荧光和Western blot结合半定量分析,描述了子午岭黑山羊正常和隐睾睾丸中重要ECM成分IV型胶原(Col IV)、层粘连蛋白(LN)和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)的分布。结果表明:组织化学染色显示隐睾中曲细精管发育不良,支持细胞数量减少,胶原纤维稀疏。同时,网状纤维分布相对丰富。此外,间质血管和曲细精管固有层中的PAS和AB染色较弱。免疫组织化学和免疫荧光显示,Col IV、LN在正常睾丸的Leydig细胞、支持细胞中强表达,在精原细胞和精子细胞中中等阳性,但HSPG在精原细胞中不表达。然而,在隐睾中,Col IV、LN和HSPG在Leydig细胞、支持细胞中的表达显著降低,Col IV和LN在毛细血管内皮细胞中的表达也降低,但HSPG在精原细胞中中等表达。基于这些数据,隐睾中生殖上皮发育不良、胶原纤维合成功能下降和Leydig细胞发育通常是正常的,这些与Col IV和LN的异常代谢密切相关。隐睾睾丸精原细胞中HSPG的阳性表达与精原细胞的代偿性发育有关。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
子午岭黑山羊正常和隐睾睾丸中ECM相关蛋白(Col IV、LN、HSPG)的分布有何差异?
核心机制
隐睾中Col IV和LN表达下降,与Leydig细胞、支持细胞和管周肌样细胞的功能异常相关;HSPG在精原细胞中的强阳性表达与精原细胞发育不成熟及代偿性发育有关。
主要证据
组织化学染色显示隐睾曲细精管发育不良、支持细胞数量增加、胶原纤维稀疏;免疫组化和免疫荧光显示Col IV、LN在隐睾Leydig细胞和支持细胞中表达降低,HSPG在隐睾精原细胞中强表达;Western blot证实了上述表达变化。
研究意义
为子午岭黑山羊睾丸病理和生殖生理研究提供形态学参考。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

组织学染色分析

比较正常和隐睾睾丸的组织学特征

通过H&E、Masson、Gomori银氨、AB、PAS、AB-PAS染色观察睾丸组织结构、胶原纤维、网状纤维和糖原分布。

2

免疫组织化学检测

检测Col IV、LN和HSPG在睾丸组织中的定位和表达

使用特异性抗体通过IHC检测正常和隐睾睾丸中Col IV、LN和HSPG的定位。

3

免疫荧光检测

进一步验证Col IV、LN和HSPG的定位和共定位

使用荧光标记二抗进行IF单染和双染,观察蛋白分布。

4

Western blot分析

定量检测Col IV、LN和HSPG在睾丸组织中的表达水平

提取组织总蛋白,通过Western blot检测Col IV、LN和HSPG的表达。

5

统计分析

比较正常和隐睾组之间的差异

使用SPSS统计软件对组织学参数和蛋白表达进行统计分析。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
抗IV型胶原抗体Biossbs-0806R
抗层粘连蛋白抗体Biossbs-0821R
抗核心蛋白聚糖/硫酸乙酰肝素蛋白聚糖抗体Biossbs-5072R
SP试剂盒(兔)BiossSP-0023
免疫组织化学试剂盒Solarbio--
HRP-DAB显色试剂盒Solarbio--
羊抗兔IgGBiossbs-0259G-AF488
DAPIBiossC02-04002
总蛋白提取试剂盒TransGen Biotech--
PVDF膜TransGen Biotech--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
动物与样本制备
样本来源:子午岭黑山羊,5月龄,正常和隐睾各6例;手术采集;固定方式:液氮冷冻或4%甲醛固定
阅读提示:见Methods - Animals and tissue preparation
组织化学染色
染色方法:H&E, Masson, Gomori银氨, AB (pH=2.5), PAS, AB-PAS;切片厚度未明确;染色步骤需参照文献
阅读提示:见Methods - Testicular tissue sample preparation 和结果部分
免疫组织化学
一抗浓度:0.33*10-2mg/ml;二抗稀释倍数未明确;孵育时间:4℃过夜;DAB显色时间未明确
阅读提示:见Methods - Immunohistochemistry (IHC) assay
免疫荧光
二抗浓度:0.125*10-2mg/ml;孵育时间:4℃ 1小时;双染时DAPI孵育10分钟
阅读提示:见Methods - Immunofluorescence (IF) assay 和 IF double-staining
Western blot
一抗浓度:0.01*10-2mg/ml;二抗孵育时间:37℃ 2小时;β-actin为内参;曝光条件未明确
阅读提示:见Methods - Western blot