细胞活力检测
评估不同浓度DHA和DDP单药及联合处理对HepG2细胞活力的抑制效果。
使用CCK-8试剂盒检测HepG2细胞活力，细胞以4×10^3/孔接种96孔板，分别用不同浓度DHA（37.5-400 μM）和DDP（5-40 μg/ml）处理24小时，或联合处理24、48小时，然后加入10% CCK-8孵育2小时，测450nm吸光度。
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双氢青蒿素联合顺铂对HepG2细胞增殖、凋亡和迁移的影响
Effects of dihydroartemisinin combined with cisplatin on proliferation, apoptosis and migration of HepG2 cells.
实验完整度
中体外实验为主，包括CCK-8、集落形成、流式凋亡、AO/EB染色、伤口愈合、Transwell、western blot和明胶酶谱验证，但缺乏动物模型和体内验证。
主要模型
HepG2肝癌细胞系 体外培养模型
重点核对
HepG2细胞来源：中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库 DHA浓度：100 μM；DDP浓度：低剂量10 μg/ml，中剂量15 μg/ml，高剂量20 μg/ml，处理24或48小时 细胞分组：对照组、DHA单药组、DDP单药组（MD、HD）及DHA联合DDP组（LD、MD） 关键检测：CCK-8、集落形成、Annexin V/PI流式、AO/EB染色、伤口愈合、Transwell、western blot、明胶酶谱 统计分析：单因素方差分析（Tukey事后检验）或非配对t检验，P<0.05为显著
摘要
顺铂（DDP）是一种强效且广泛应用的化疗药物。然而，其对肝癌的临床疗效受到不良反应和耐药性发展的限制。联合治疗可能缓解这些问题。双氢青蒿素（DHA）是青蒿素的第一代衍生物。DDP联合DHA对肝癌的作用此前尚未被研究。因此，本研究旨在探讨DHA联合DDP对HepG2细胞的影响及其潜在的分子机制。用不同浓度的DHA和/或DDP处理HepG2细胞。采用Cell Counting Kit-8实验评估细胞活力。通过流式细胞术、吖啶橙/溴化乙锭（AO/EB）荧光双染和集落形成实验定量细胞增殖和凋亡。通过Transwell和伤口愈合实验定量细胞迁移。通过western blotting检测HepG2细胞中Fas、Fas相关死亡结构域（FADD）、pro-caspase-3、cleaved caspase-3、pro-caspase-8、cleaved caspase-8、Bax、Bcl-2、E-cadherin和N-cadherin的蛋白表达水平。明胶酶谱法用于评估HepG2细胞分泌到上清液中的MMP-9水平。与仅用DDP处理的细胞相比，DHA和DDP联合处理后，凋亡细胞百分比显著增加，而细胞增殖和迁移显著减少。DHA和DDP联合使用显著抑制MMP-9的表达，显著增加Fas、FADD、Bax和E-cadherin的蛋白表达水平，显著增加cleaved caspase-3和cleaved caspase-8与前体蛋白的比值，并显著降低Bcl-2和N-cadherin的蛋白表达水平。本研究的发现表明，DHA可能与DDP协同作用，可能促进凋亡和抑制上皮-间质转化，用于治疗肝癌。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 双氢青蒿素（DHA）联合顺铂（DDP）是否增强对肝癌HepG2细胞增殖、凋亡和迁移的抑制作用，以及其潜在分子机制。
- 核心机制
- DHA与DDP联合通过Fas死亡受体信号通路和线粒体凋亡信号通路增强凋亡，并通过调节E-cadherin、N-cadherin和MMP-9表达抑制上皮-间质转化。
- 主要证据
- CCK-8和集落形成实验显示联合组增殖抑制增强；Annexin V/PI流式和AO/EB染色显示联合组凋亡率升高；western blot显示Fas、FADD、Bax、cleaved caspase-3/8升高及Bcl-2降低；明胶酶谱显示MMP-9降低，E-cadherin升高、N-cadherin降低。
- 研究意义
- 作者提出DHA可能作为DDP的新型抗肿瘤增敏剂，为DHA与DDP联合用于肝癌临床治疗提供实验依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
增殖能力检测
评估DHA联合DDP对HepG2细胞集落形成能力（增殖）的影响。
HepG2细胞以500/孔接种六孔板，用上述浓度的DHA和/或DDP处理12小时，换新鲜培养基后培养2周，固定、Giemsa染色，计数超过50个细胞的集落数。
细胞凋亡检测（AO/EB双染）
观察DHA联合DDP诱导的细胞凋亡形态变化。
HepG2细胞以5×10^5/孔接种于六孔板盖玻片上，处理24小时后，用AO/EB染色5分钟，荧光显微镜观察凋亡细胞并计算凋亡率。
细胞凋亡检测（流式细胞术）
定量评估DHA联合DDP对HepG2细胞凋亡率的影响。
1×10^6/孔HepG2细胞处理24小时后，收集、用FITC-Annexin V和PI染色，通过流式细胞仪检测凋亡细胞百分比。
细胞迁移检测（伤口愈合）
评估DHA联合DDP对HepG2细胞迁移能力的影响。
HepG2细胞1×10^6/孔接种六孔板，划痕后，用无血清培养基和上述浓度药物处理24小时，通过测量伤口面积变化计算迁移率。
细胞迁移检测（Transwell）
进一步验证DHA联合DDP对HepG2细胞迁移能力的影响。
HepG2细胞以2×10^5/孔接种于Transwell上室，下室含10% FBS培养基，处理24小时后，固定、染色，计数迁移到下室面的细胞数量。
凋亡相关蛋白表达检测
探究DHA联合DDP对凋亡相关蛋白表达的影响。
收集处理后的细胞蛋白，western blotting检测Fas、FADD、pro-caspase-3、cleaved caspase-3、pro-caspase-8、cleaved caspase-8、Bax、Bcl-2蛋白表达。
迁移相关蛋白及MMP-9检测
探究DHA联合DDP对EMT相关蛋白和MMP-9表达的影响。
western blotting检测E-cadherin和N-cadherin表达；明胶酶谱法检测HepG2细胞上清液中MMP-9的活性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | HyClone; Cytiva | -- |
| 胎牛血清 | Hangzhou Sijiqing Biological Engineering Materials Co., Ltd. | -- | |
| 药物处理 | 顺铂 | Qilu Pharmaceutical Co., Ltd. | -- |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂盒 | Dalian Meilun Biology Technology Co., Ltd. | -- |
| 集落形成实验 | 吉姆萨染液 | Beyotime Institute of Biotechnology | -- |
| 凋亡检测 | FITC-Annexin V/PI凋亡检测试剂盒 | Tianjin Sungene Biotech Co., Ltd. | -- |
| 吖啶橙 | Sigma-Aldrich; Merck KGaA | 158550-10G | |
| 溴化乙锭 | Sigma-Aldrich; Merck KGaA | E8751-5G | |
| 凋亡检测（荧光显微镜） | 荧光显微镜（型号80i） | Nikon Corporation | -- |
| 迁移检测（显微镜） | 倒置光学显微镜（型号CK-40） | Olympus Corporation | -- |
| 迁移检测 | Transwell小室（8 μm） | Corning, Inc. | -- |
| 明胶酶谱 | 明胶 | Shanghai Yuanye Bio-technology, Co., Ltd. | -- |
| 考马斯亮蓝R-250 | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. | -- | |
| 蛋白提取 | RIPA裂解液 | Beyotime Institute of Biotechnology | -- |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime Institute of Biotechnology | -- |
| Western blot | 抗Fas抗体 | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | K008079P |
| 抗FADD抗体 | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | K008372P | |
| 抗pro-caspase-3抗体 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-7272 | |
| 抗cleaved caspase-3抗体 | Cell Signaling Technology, Inc. | Asp175 | |
| 抗pro-caspase-8抗体 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | bsm33190M | |
| 抗cleaved caspase-8抗体 | Cell Signaling Technology, Inc. | Asp384 | |
| 抗Bax抗体 | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | K008076P | |
| 抗Bcl-2抗体 | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | K003505P | |
| 抗N-cadherin抗体 | BIOSS | bs-1172R | |
| 抗E-cadherin抗体 | BIOSS | bs-1519R | |
| 山羊抗兔IgG二抗 | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | SE134 | |
| 山羊抗小鼠IgG二抗 | BIOSS | bs-40296G-HRP | |
| 抗β-actin抗体 | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | K200058M | |
| Western blot（显影） | ECL化学发光试剂 | Wuhan Servicebio Biotechnology Co., Ltd. | -- |
| Western blot（成像） | 凝胶成像系统（ChemiDoc XRS+） | Bio-Rad Laboratories, Inc. | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | HepG2细胞来源：中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；培养条件：RPMI-1640培养基+10% FBS+100 U/ml青霉素+100 U/ml链霉素，37°C、5% CO2。 阅读提示：Materials and methods: Cell culture and reagents |
| 药物处理 | DHA浓度：100 μM；DDP浓度：低剂量10 μg/ml、中剂量15 μg/ml、高剂量20 μg/ml；处理时间：24小时（部分实验48小时）。 阅读提示：Materials and methods: Cell grouping |
| 细胞活力检测（CCK-8） | 细胞密度：4×10^3/孔；DHA浓度梯度：37.5-400 μM；DDP浓度梯度：5-40 μg/ml；处理时间：24小时；CCK-8孵育时间：2小时；检测波长：450 nm。 阅读提示：Materials and methods: Cell counting kit-8 (CCK-8) assay; Figure 1B-D |
| 集落形成实验 | 细胞密度：500个/孔；处理时间：12小时；培养时间：2周；固定：无水乙醇15分钟；染色：10% Giemsa 15分钟；集落计数标准：>50个细胞。 阅读提示：Materials and methods: Colony formation assay; Figure 1E-F |
| 流式凋亡检测 | 细胞密度：1×10^6/孔；处理时间：24小时；染色：5 μl FITC-Annexin V 30分钟，10 μl PI 30分钟。 阅读提示：Materials and methods: Flow cytometry; Figure 2C-D |
| AO/EB双染 | 细胞密度：5×10^5/孔；处理时间：24小时；染色时间：5分钟；观察：随机5个视野；凋亡计数：每1000个细胞中凋亡细胞比例。 阅读提示：Materials and methods: AO/EB dual staining assay; Figure 2A-B |
| 伤口愈合实验 | 细胞密度：1×10^6/孔；划痕工具：20 μl移液枪头；处理时间：24小时；使用无血清培养基。 阅读提示：Materials and methods: Wound healing assay; Figure 3A-B |
| Transwell迁移实验 | 细胞密度：2×10^5/孔（上室）；下室培养基：600 μl含10% FBS；处理时间：24小时；计数：随机5个视野（×200）。 阅读提示：Materials and methods: Transwell migration assay; Figure 3C-D |
| Western blot | 处理时间：24小时；裂解：RIPA裂解液（含蛋白酶抑制剂）；上样量：20 μg蛋白/孔；一抗稀释比例：1:1000；二抗稀释比例：1:1000。 阅读提示：Materials and methods: Western blotting; Figures 4 and 5A-D |
| 明胶酶谱 | 处理时间：24小时；上清液量：30 μl；明胶浓度：1 mg/ml；孵育时间：18小时。 阅读提示：Materials and methods: Gelatin zymography; Figure 5E-F |