建立pSNL模型并验证疼痛行为
建立神经病理性疼痛动物模型并确认疼痛行为发展。
对成年雄性SD大鼠进行部分坐骨神经结扎（pSNL）或假手术，术后10天检测机械性异常性疼痛和热痛觉过敏。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
植物激素脱落酸通过调节脊髓LANCL2蛋白丰度和胶质细胞活化改善神经病理性疼痛
Phytohormone abscisic acid ameliorates neuropathic pain via regulating LANCL2 protein abundance and glial activation at the spinal cord.
实验完整度
高包含pSNL大鼠模型、行为学测试、Western blot、免疫组化、siRNA敲低、体内药物孵育等多层级实验，并进行了功能验证（ABA治疗）和机制验证（LPS/TLR4、Gi蛋白）。
主要模型
pSNL大鼠模型 脊髓背角组织 大鼠原代脊髓细胞
重点核对
pSNL手术方式（部分坐骨神经结扎约2/3厚度） ABA给药剂量（全身20 mg/kg i.p.，鞘内15 μg/rat） LANCL2 siRNA敲低方案（2 μg/injection, 2次/天, 2天） LPS浓度（0.1 μg/ml）及孵育时间（2h） 行为学测试时间点
摘要
脊髓神经炎症在神经病理性疼痛的发生中起关键作用。越来越多的数据表明，植物激素脱落酸（ABA）可调节哺乳动物的炎症过程。本研究发现，脊髓中LANCL2受体蛋白的减少（而非激动剂ABA的减少）与神经病理性疼痛的发生相关。全身或鞘内给予ABA可改善部分坐骨神经结扎（pSNL）动物的机械性异常性疼痛和热痛觉过敏的发展和预存在。LANCL2仅在脊髓背角的小胶质细胞中表达。预先给予ABA可减弱pSNL大鼠背角小胶质细胞和星形胶质细胞的活化、ERK活性和TNFα蛋白丰度，并伴随脊髓LANCL2蛋白丰度的恢复。用siRNA敲低脊髓LANCL2基因可重现pSNL诱导的行为和脊髓分子变化。用脂多糖激活脊髓Toll样受体4（TLR4）可导致小胶质细胞活化和TNFα过度产生，同时伴有LANCL2和过氧化物酶体增殖物激活受体γ蛋白水平降低。当ABA与LPS共同作用时，这些变化得到改善。ABA诱导的抗炎作用不依赖Gi蛋白活性。我们的研究表明，ABA/LANCL2系统是调节脊髓神经炎症和伤害性信息处理的强大内源性系统，提示ABA在神经病理性疼痛治疗中的潜在应用价值。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 脊髓ABA/LANCL2系统是否参与神经病理性疼痛的发病机制，外源性ABA能否通过调节该系统改善疼痛。
- 核心机制
- ABA通过激活LANCL2，抑制小胶质细胞和星形胶质细胞活化、降低ERK活性和TNFα产生，并恢复LANCL2和PPARγ蛋白水平，从而减轻神经炎症和疼痛。
- 主要证据
- pSNL大鼠脊髓LANCL2表达降低；ABA治疗减轻疼痛行为并抑制胶质细胞活化；siRNA敲低LANCL2重现疼痛和分子变化；ABA抑制LPS诱导的炎症」。
- 研究意义
- 揭示ABA/LANCL2系统是调节脊髓神经炎症和疼痛的内源性系统，提示ABA作为神经病理性疼痛治疗药物的潜在价值。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测ABA水平和LANCL2表达
评估神经损伤后脊髓背角ABA水平和LANCL2蛋白表达的变化。
用ELISA检测ABA浓度，用Western blot检测LANCL2蛋白水平。
ABA治疗实验
验证ABA能否预防或逆转神经病理性疼痛行为。
分别进行预防性治疗（术前30分钟腹腔注射ABA，持续10天）和已有疼痛大鼠的急性治疗（腹腔或鞘内注射ABA），观察行为学变化。
免疫组化定位LANCL2
确定LANCL2在脊髓背角的细胞类型。
使用免疫荧光双标染色，将LANCL2与Iba1、GFAP、NeuN共染。
检测胶质细胞活化和炎症因子
评估ABA治疗对胶质细胞活化、ERK活性和TNFα表达的影响。
使用Western blot检测Iba1、GFAP、p-ERK、TNFα和LANCL2蛋白水平。
siRNA敲低LANCL2验证因果性
确认LANCL2在神经病理性疼痛中的因果作用。
鞘内注射LANCL2 siRNA或对照siRNA，检测行为学和分子变化。
体外药物孵育实验
探究TLR4激活与ABA/LANCL2系统的相互作用。
通过脊髓表面棉片孵育LPS或ABA，检测分子变化。
Gi蛋白依赖性实验
验证ABA的抗炎作用是否依赖Gi蛋白。
使用PTX（Gi蛋白抑制剂）预处理，观察ABA对LPS诱导炎症的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 手术 | 5-0丝线缝合线 | -- | -- |
| ELISA | ABA ELISA试剂盒 | MyBiosource | MBS2000214 |
| 药物处理 | 脱落酸 | PhytoTechnology Laboratories | -- |
| 基因敲低 | LANCL2 siRNA | Santa Cruz Biotechnology | -- |
| 对照siRNA | Santa Cruz Biotechnology | -- | |
| i-Fect转染试剂 | Neuromics | -- | |
| Western blot | anti-LANCL2抗体 | Bioss Antibodies | -- |
| anti-phospho-ERK抗体 | Cell Signaling | -- | |
| anti-ERK抗体 | Cell Signaling | -- | |
| anti-GFAP抗体 | Cell Signaling | -- | |
| anti-Iba-1抗体 | Abcam | -- | |
| anti-TNFα抗体 | Millipore | -- | |
| PPARγ抗体 | Santa Cruz | -- | |
| anti-β-Actin抗体 | Cell Signaling | -- | |
| GAPDH抗体 | Proteintech | -- | |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| ECL发光液 | Pierce | -- | |
| Odyssey Fc成像系统 | LI-COR Biosciences | -- | |
| 免疫组化 | anti-LANCL2抗体 | Invitrogen | -- |
| anti-GFAP抗体 | Cell Signaling | -- | |
| anti-Iba1抗体 | Santa Cruz | -- | |
| anti-NeuN抗体 | Cell Signaling | -- | |
| Texas Red抗体 | Vector Laboratories | -- | |
| Alexa Fluor 488抗体 | Life Technologies | -- | |
| Vectashield封片剂 | Vector Laboratories | -- | |
| 奥林巴斯BX43显微镜 | Olympus | -- | |
| 药物处理 | 聚乙烯（PE-10）导管 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| pSNL手术 | 大鼠品系、性别、体重；麻醉剂（异氟烷2-3%）；手术细节（部分坐骨神经结扎约2/3厚度，5-0丝线） 阅读提示：参见Methods部分：Animals和Partial sciatic nerve ligation |
| 行为学测试 | von Frey纤维力度范围（0.6-26g）；热刺激切断时间（20s）；大鼠适应时间和测试次数 阅读提示：参见Methods部分：Behavior tests |
| ABA给药 | 给药途径（i.p.或i.t.）；剂量（全身20 mg/kg，鞘内15 μg或1.5 μg/rat）；给药时间（预防性每日一次，治疗性单次） 阅读提示：参见Methods部分：Drug administration |
| siRNA敲低 | siRNA剂量（2 μg/次）；给药频率（每天2次×2天）；转染试剂（i-Fect）及比例（1:5）；行为学检测时间 阅读提示：参见Methods部分：Administration of siRNA |
| 体外药物孵育 | LPS浓度（0.1 μg/ml）和孵育时间（2h）；ABA浓度（20 μM）和预处理时间（30min） 阅读提示：参见Methods部分：In vivo drug incubation及Results部分相关描述 |
| Western blot | 抗体稀释比例（如LANCL2 1:750, p-ERK 1:1000等）；内参蛋白（β-actin或GAPDH） 阅读提示：参见Methods部分：Western blot experiments |