circSCAF8的鉴定与特征分析
验证circSCAF8的结构和稳定性，明确其亚细胞定位。
通过滚环反转录和Sanger测序确认circSCAF8序列，使用发散/收敛引物和RNase R处理验证其环状结构，通过细胞质核分离和FISH检测其定位。
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circSCAF8通过circSCAF8-miR-140-3p/miR-335-LIF通路促进前列腺癌的生长和转移
CircSCAF8 promotes growth and metastasis of prostate cancer through the circSCAF8-miR-140-3p/miR-335-LIF pathway.
实验完整度
高包含体外细胞功能实验、体内皮下/原位/转移瘤模型、临床组织样本分析及双荧光素酶报告等机制验证，证据层级丰富。
主要模型
前列腺癌细胞系PC3和22RV1 小鼠皮下及原位移植瘤模型（BALB/c裸鼠） 小鼠尾静脉转移模型（NOD/SCID小鼠） 前列腺癌患者组织样本（85例PCa，30例BPH）
重点核对
circSCAF8表达与前列腺癌进展的相关性（R2=0.635） shRNA敲低circSCAF8对PCa细胞增殖、迁移、侵袭的抑制作用 双荧光素酶报告实验验证circSCAF8与miR-140-3p/miR-335的直接结合 LIF作为miR-140-3p和miR-335靶基因的验证 体内实验中circSCAF8敲低对肿瘤生长和转移的抑制效应
摘要
环状RNA（circRNA）越来越多地与癌症进展相关联。然而，circRNA在前列腺癌（PCa）中的详细生物学功能仍不清楚。通过高通量circRNA测序，我们先前鉴定了18种尿液细胞外囊泡circRNA，与良性前列腺增生患者相比，其在PCa患者中升高。对30名PCa患者肿瘤组织和匹配尿液细胞外囊泡中18种circRNA表达水平的Spearman相关分析显示，circSCAF8具有最高的R2（R2=0.635，P<0.001）。使用Cox比例风险回归模型评估circSCAF8对无进展生存期的影响。进行体外和体内功能实验以研究circSCAF8对PCa表型的影响。我们发现，在PCa细胞中敲低circSCAF8抑制了增殖、迁移和侵袭能力，而过表达circSCAF8则产生相反的效果。在体内观察到类似的结果。在接受根治性前列腺切除术的85名患者队列中，PCa组织中circSCAF8表达是无进展生存期的有力预测因子（HR=2.14，P=0.022）。机制上，circSCAF8可通过结合miR-140-3p和miR-335调节LIF表达，并激活LIF-STAT3通路，导致PCa的生长和转移。总的来说，我们的发现表明circSCAF8通过circSCAF8-miR-140-3p/miR-335-LIF通路促进PCa进展。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- circSCAF8在前列腺癌中的生物学功能和潜在分子机制是什么？
- 核心机制
- circSCAF8通过海绵吸附miR-140-3p和miR-335，解除其对LIF的抑制，上调LIF表达，激活LIF-STAT3信号通路，从而促进PCa的生长和转移。
- 主要证据
- 体外细胞功能实验、体内移植瘤模型、临床样本分析及双荧光素酶报告实验等证实circSCAF8-miR-140-3p/miR-335-LIF轴的作用。
- 研究意义
- circSCAF8可能成为PCa新的诊断/预后标志物和治疗靶点，尿液circSCAF8检测作为一种液体活检方法具有重复性好、微创和易于实施的潜力。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
circSCAF8在PCa组织和尿液中的表达及临床意义
分析circSCAF8在PCa组织和尿液EV中的表达水平及其与临床病理特征和预后的关系。
qRT-PCR和FISH检测PCa和BPH组织及尿液EV中circSCAF8表达，并进行Spearman相关性分析和Cox回归分析评估其预后价值。
体外功能实验验证circSCAF8对PCa细胞表型的影响
验证circSCAF8对PCa细胞增殖、迁移、侵袭、细胞周期和凋亡的功能影响。
通过shRNA敲低和质粒过表达circSCAF8，使用CCK-8、集落形成、EdU、Transwell、伤口愈合、流式细胞术检测细胞功能变化。
circSCAF8海绵吸附miR-140-3p和miR-335的机制验证
验证circSCAF8是否直接结合miR-140-3p和miR-335，并参与ceRNA机制。
使用Circinteractome数据库预测靶miRNA，通过qRT-PCR检测miRNA表达变化，双荧光素酶报告实验和RNA pull-down验证circSCAF8与miRNA的直接结合。
LIF作为miR-140-3p和miR-335靶基因的验证
验证LIF是miR-140-3p和miR-335的直接靶基因。
通过生物信息学预测LIF为靶基因，qRT-PCR和western blot检测miRNA mimics/inhibitors对LIF表达的影响，双荧光素酶报告实验验证miRNA与LIF 3'UTR的结合。
circSCAF8-miR-140-3p/miR-335-LIF轴的调控机制
阐明circSCAF8通过miRNAs调控LIF及其下游信号通路的机制。
检测circSCAF8表达变化对LIF及其下游蛋白（p-STAT3, MMP-2, MMP-9, VEGFA, CyclinD1）表达的影响，并通过rescue实验验证miRNAs在其中的中介作用。
体内实验验证circSCAF8的功能
验证circSCAF8在体内的致癌作用及其对PCa生长和转移的影响。
建立皮下、原位和转移瘤模型，注射敲低circSCAF8的PC3或RM-1细胞，观察肿瘤生长和转移情况，并通过IHC检测肿瘤组织中相关蛋白的表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Bioss | -- |
| DMEM培养基 | Biosharp | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 角质细胞无血清培养基 | Gibco | -- | |
| 牛垂体提取物 | Lonza | -- | |
| 质粒构建和转染 | pCDNA3.1载体 | GenePharma | -- |
| 聚凝胺 | GenePharma | -- | |
| 脂质体3000转染试剂 | Invitrogen | -- | |
| 双荧光素酶报告实验 | pmiR-Glo荧光素酶报告载体 | RiboBio | -- |
| 双荧光素酶报告检测试剂盒 | Promega | -- | |
| RNA/gDNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| RNA提取 | 细胞质和细胞核RNA纯化试剂盒 | -- | -- |
| 反转录 | PrimeScript反转录试剂盒 | Takara | -- |
| gDNA提取 | PureLink基因组DNA小提试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| RNase R处理 | RNase R酶 | Geenseed | -- |
| RNA pull-down | 链霉亲和素磁珠 | MCE | -- |
| 蛋白酶K | Sangon Biotech | -- | |
| FISH | FISH试剂盒 | RiboBio | -- |
| qRT-PCR | TB Green预混Ex Taq | Takara | -- |
| LightCycler 480II实时荧光定量PCR仪 | Roche | -- | |
| Western blot | 总蛋白提取试剂盒 | KeyGEN | -- |
| BCA蛋白检测试剂盒 | KeyGEN | -- | |
| LIF抗体 | Abcam | ab138002 | |
| STAT3抗体 | Abcam | ab68153 | |
| p-STAT3抗体 | Abcam | ab267373 | |
| Ago2抗体 | Abcam | ab186733 | |
| CyclinD1抗体 | Abcam | ab226977 | |
| VEGFA抗体 | Cell Signaling Technology | 65373 | |
| MMP-2抗体 | Cell Signaling Technology | 4022 | |
| MMP-9抗体 | Cell Signaling Technology | 2270 | |
| GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 3683 | |
| 二抗 | Bioss | bs-0295G | |
| Western ECL底物 | Advansta | -- | |
| ChemiDoc成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| IHC | LIF抗体 | Abcam | ab138002 |
| p-STAT3抗体 | Abcam | ab267373 | |
| CyclinD1抗体 | Abcam | ab226977 | |
| VEGFA抗体 | Cell Signaling Technology | 65373 | |
| MMP-2抗体 | Cell Signaling Technology | 4022 | |
| MMP-9抗体 | Cell Signaling Technology | 2270 | |
| 二抗 | Bioss | bs-0295G | |
| 细胞增殖 | CCK-8试剂 | Dojindo | -- |
| EDU试剂 | BD Bioscience | -- | |
| 细胞周期 | RNase A | KeyGEN | -- |
| 碘化丙啶 | KeyGEN | -- | |
| 细胞凋亡 | Annexin V-FITC和PI | KeyGEN | -- |
| 动物实验 | 基质胶 | BD | -- |
| AniView100成像系统 | BLT | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源和培养基（PC3, 22RV1在RPMI 1640；C4-2, LNCaP, 293T在DMEM；RWPE-1在K-SFM），FBS浓度，培养条件（37°C, 5% CO2） 阅读提示：见Materials and methods中的Cell lines部分 |
| 敲低/过表达 circSCAF8 | shRNA靶序列（sh1-circSCAF8, sh2-circSCAF8），sh-NC对照序列，过表达载体pCDNA3.1-circSCAF8，转染方式（lentivirus+Polybrene，puromycin筛选） 阅读提示：见Materials and methods中的Plasmid construction and cell transfection部分 |
| 体外功能实验 | CCK-8、集落形成、EdU、Transwell、伤口愈合、细胞周期和凋亡实验的具体条件（如细胞密度、培养时间、试剂浓度） 阅读提示：见Materials and methods中的Cell proliferation assay、Transwell invasion and migration assays、Wound healing assay、Cell cycle and apoptosis assays部分 |
| miRNA和靶基因验证 | miRNA mimics/inhibitors序列，双荧光素酶报告载体构建（circSCAF8-WT/MUT, LIF-WT/MUT），RNA pull-down探针序列，转染试剂和细胞系 阅读提示：见Materials and methods中的Luciferase reporter assay、RNA pull-down assay部分 |
| 体内动物模型 | 动物品系（BALB/c裸鼠、NOD/SCID小鼠），年龄（4-6周），性别（雄性），细胞注射数量（2×10^6），注射方式（皮下、原位、尾静脉），观察时间（皮下4周、原位5周、转移4周），肿瘤测量方法 阅读提示：见Materials and methods中的Animal study部分 |
| 临床样本分析 | 样本来源（85例PCa组织，30例BPH组织），尿液EV提取方法，circSCAF8表达检测方法（qRT-PCR, FISH），统计方法（Spearman相关、Cox回归） 阅读提示：见Materials and methods中的Study on patients’ tissues和Statistical analysis部分 |