鉴定人类CEP128纯合错义变异
确定两名不育兄弟的遗传病因
通过全外显子测序（WES）对近亲家族的两个不育兄弟进行遗传分析，并使用Sanger测序验证候选变异。
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CEP128参与人类和小鼠的精子发生
CEP128 is involved in spermatogenesis in humans and mice.
实验完整度
高包含人类样本（不育兄弟精液分析、WES）、体外细胞实验、两种小鼠模型（KO和KI）的功能验证，以及蛋白质组、磷酸化组和RNA-seq等多组学机制验证。
主要模型
人类不育兄弟（隐精子症患者）精液样本 hRPE-1细胞（初级纤毛模型） Cep128敲除（KO）小鼠 Cep128R222Q敲入（KI）小鼠
重点核对
患者精子形态和超微结构缺陷（光镜、SEM、TEM） CEP128纯合错义变异（c.665G>A）的鉴定和验证 Cep128 KO和KI小鼠模型的建立和验证 Cep128 KO和KI小鼠的精子参数（CASA）和生育力测试 蛋白质组、RNA-seq和磷酸化蛋白质组分析
摘要
中心体蛋白是中心体的必要组成部分，中心体是一种保守的真核细胞器，对生殖过程至关重要。然而，很少有中心体蛋白在遗传上被证实与生育力相关联。在此，我们在两名不育男性中鉴定出一个纯合的CEP128错义变异（c.665G>A [p.R222Q]）。值得注意的是，携带直系同源CEP128R222Q变异的纯合敲入雄性小鼠表现出精子形态、数量和活力的异常。此外，Cep128敲除雄性小鼠表现为与精子质量破坏相关的雄性不育。我们在纯合Cep128 KO和KI小鼠中均观察到精子鞭毛缺陷；其他器官的纤毛发育正常——这表明CEP128变异主要影响睾丸中的纤毛发生。在机制上，CEP128通过调控精子发生过程中基因的表达和/或TGF-β/BMP信号通路成员的磷酸化参与雄性生殖。总之，我们的发现揭示了CEP128在雄性生育力中的关键作用，并为中心体蛋白在生殖生物学中的功能提供了重要见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CEP128在雄性生殖中的作用及其变异导致不育的机制是什么？
- 核心机制
- CEP128通过调控精子发生相关基因的表达（如Wbp2nl、Rcbtb2、Prss55、Crisp1、Defb22、Sun5、Tssk4）以及TGF-β/BMP信号通路成员（如Rbl1、Gata4、Trim33）的磷酸化来参与雄性生殖。CEP128水平异常（过表达或缺失）抑制这些关键分子的功能，导致精子发育异常和受精能力下降。
- 主要证据
- 人类遗传学证据（WES鉴定纯合变异）、细胞实验（CEP128R222Q破坏纤毛生长和中心体蛋白表达）、小鼠模型（KO和KI小鼠显示精子参数异常、鞭毛超微结构缺陷、生育力下降）、蛋白质组和转录组及磷酸化蛋白质组分析显示相关基因和蛋白表达及磷酸化改变。
- 研究意义
- 阐明CEP128在雄性生殖中的关键作用，为理解中心体蛋白在生殖生物学中的功能提供见解，并为男性不育的基因诊断和治疗策略提供潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
分析变异对精子形态和超微结构的影响
评估CEP128变异对精子形态和超微结构的影响
使用光学显微镜、扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）分析患者精子形态和超微结构。
细胞实验评估变异对纤毛发生的影响
探究CEP128R222Q变异对初级纤毛生长和中心体蛋白表达的影响
在293T和hRPE-1细胞中过表达野生型或R222Q突变型CEP128，通过Western blot和免疫荧光检测蛋白表达和纤毛形态。
构建并验证Cep128敲除和敲入小鼠模型
确定Cep128在雄性生殖中的作用
使用CRISPR-Cas9技术生成Cep128 KO和KI小鼠，通过Sanger测序、qPCR和Western blot验证基因型，并进行生育力测试和精子分析。
分析小鼠精子形态和超微结构缺陷
表征Cep128 KO和KI小鼠的精子形态和超微结构异常
使用光学显微镜和TEM分析精子形态和超微结构，特别是鞭毛和连接段。
揭示CEP128调控生殖的分子机制
确定CEP128影响精子发生和受精的分子机制
通过蛋白质组学、RNA-seq和磷酸化蛋白质组学分析小鼠睾丸，鉴定差异表达蛋白和基因，以及差异磷酸化位点，并通过免疫荧光、qPCR、Co-IP和泛素化实验验证关键分子。
评估ICSI治疗预后
评估CEP128变异对ICSI治疗结果的影响
对患者和Cep128突变小鼠进行ICSI，观察受精率和胚胎发育情况。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 全外显子测序 | QIAamp DNA血液迷你试剂盒 | QIAGEN | 51104 |
| Agilent SureSelect人类全外显子V6试剂盒 | Agilent Technologies | G9706K | |
| Illumina HiSeq X系统 | Illumina | -- | |
| 蛋白质组学 | LTQ Orbitrap XL质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 磷酸化蛋白质组学 | Q Exactive HF-X质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| RNA测序 | Dynabeads mRNA纯化试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 61006 |
| Ribo-Zero rRNA去除试剂盒 | Illumina | MRZPL1224 | |
| Agilent 2100生物分析仪 | Agilent Technologies | -- | |
| TruSeq RNA文库制备试剂盒v2 | Illumina | RS-122-2001 | |
| Illumina HiSeq 4000测序系统 | Illumina | -- | |
| 动物模型构建 | pX260质粒 | Addgene | -- |
| KOD-Plus-Neo高保真酶 | TOYOBO | KOD-401 | |
| 通用DNA纯化试剂盒 | TIANGEN | DP214 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 ULTRA试剂盒 | Life Technologies | AM1345 | |
| pX330质粒 | Addgene | -- | |
| MEGAshortscript T7试剂盒 | Life Technologies | AM1354 | |
| MEGAclear试剂盒 | Life Technologies | AM1908 | |
| KSOM培养基 | Millipore | MR-106-D | |
| RNA提取和qPCR | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | 15596026 |
| SuperScript IV逆转录酶 | Thermo Fisher Scientific | 18090010 | |
| KiCqStart SYBR Green qPCR预混液 | Sigma-Aldrich | KCQS00 | |
| qPCR | iCycler RT-PCR检测系统 | Bio-Rad Laboratories | -- |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | 11965092 |
| 胎牛血清 | Sigma-Aldrich | F8318 | |
| DMEM/F12培养基 | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| pENTER-Flag-WT-CEP128质粒 | Vigene Biosciences | -- | |
| KOD-Plus-诱变试剂盒 | Toyobo | SMK-101 | |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | L3000015 | |
| Western blot/免疫共沉淀 | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013B |
| Halt蛋白酶抑制剂混合物 | Thermo Fisher Scientific | 78425 | |
| 磷酸酶抑制剂混合物 | Sigma-Aldrich | P5726 | |
| SDS上样缓冲液 | Beyotime | P0015 | |
| PVDF膜 | Millipore | IPVH00010 | |
| 免疫共沉淀 | Protein A/G磁珠 | Thermo Fisher Scientific | 88802 |
| 免疫荧光染色 | Alexa Fluor 488荧光染料 | Thermo Fisher Scientific | A21206 |
| Alexa Fluor 594荧光染料 | Thermo Fisher Scientific | A11005 | |
| 4',6-二脒基-2-苯基吲哚 | Sigma-Aldrich | 28718-90-3 | |
| 奥林巴斯FV3000共聚焦显微镜 | Olympus | -- | |
| 精子染色 | 多聚赖氨酸 | Beyotime | ST509 |
| Sigmacote试剂 | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| 组织切片染色 | 蔡司Axio Imager 2显微镜 | Zeiss | -- |
| 电子显微镜 | 日立S3400扫描电镜 | Hitachi | -- |
| Em UC6超薄切片机 | Leica | -- | |
| TECNAI G2 F20透射电镜 | Philips | -- | |
| ICSI | 马绒毛膜促性腺激素 | ProSpec | HOR-272 |
| 人绒毛膜促性腺激素 | Easycheck | M2530 | |
| Chatot-Ziomek-Bavister培养基 | Easycheck | M2750 | |
| HTF培养基 | Easycheck | M1150 | |
| Whitten's-Hepes培养基 | Gibco | 12360-038 | |
| 细胞松弛素B | Sigma-Aldrich | C-6762 | |
| G1-Plus培养基 | Vitrolife | 10132 | |
| Western blot | 抗CEP128抗体 | Sigma-Aldrich | HPA001116 |
| 免疫荧光 | 抗乙酰化微管蛋白抗体 | Abcam | ab24610 |
| Western blot | 抗NIN抗体 | ABclonal | A8215 |
| 抗CEP170抗体 | Proteintech | 27325-1-AP | |
| 抗YY1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7341 | |
| 抗GR-β抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-393232 | |
| 免疫荧光 | 抗SEPT4抗体 | ABclonal | A10238 |
| Western blot/免疫荧光 | 抗RCBTB2抗体 | Proteintech | 13225-1-AP |
| 抗WBP2NL抗体 | Proteintech | 22587-1-AP | |
| 抗CRISP1抗体 | R&D Systems | MAB4675 | |
| 抗PRSS55抗体 | Bioss | bs-19443R | |
| 免疫共沉淀 | 抗泛素抗体 | Abcam | ab7780 |
| Western blot | 抗GAPDH抗体 | Abcam | ab8245 |
| 抗CEBPβ抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7962 | |
| 抗centriolin抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-365521 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 患者样本分析 | 精液样本离心条件（3000×g，15分钟）；精子形态和超微结构分析（光镜、SEM、TEM） 阅读提示：Methods: 未明确说明；Results: 图1及正文 |
| 全外显子测序 | DNA提取试剂盒、外显子捕获试剂盒、测序平台、平均测序深度 阅读提示：Methods: Whole-exome sequencing and Sanger sequencing |
| 细胞实验 | 细胞系（293T、hRPE-1）、质粒构建、转染试剂、血清饥饿时间 阅读提示：Methods: Cell culture and plasmid construction; Results: 图3 |
| 动物模型构建 | 小鼠品系、CRISPR-Cas9注射方法、供体模板设计 阅读提示：Methods: Generation of animal models; Supplementary Table 5 |
| 精子分析 | 精子采集部位（附睾和输精管）、CASA参数 阅读提示：Methods: 未明确说明；Results: Table 1 |
| 蛋白质组学和转录组学 | 睾丸组织来源（8周龄C57BL/6小鼠）、TMT标记、LC-MS/MS仪器 阅读提示：Methods: Proteomic analysis, RNA-sequencing analysis |
| 磷酸化蛋白质组学 | 睾丸组织来源、磷酸化富集方法、质谱仪器 阅读提示：Methods: Phosphoproteomics analysis |
| ICSI | 卵母细胞来源、精子处理、注射方法 阅读提示：Methods: Intracytoplasmic sperm injection (ICSI) |
| 统计 | 统计方法（双尾学生t检验）、显著性阈值（p<0.05） 阅读提示：Methods: Statistical analysis |