Isolation and Characterization of Natural Nanoparticles in Naoluo Xintong Decoction and Their Brain Protection Research.
包含纳米颗粒分离表征（粒径、电位、TEM/SEM、红外、UPLC-Q-TOF-MS）和MCAO大鼠模型体内功能验证（神经功能评分、梗死体积、HE染色、氧化应激、凋亡及Western blot机制验证）。
MCAO大鼠模型（雄性Sprague-Dawley大鼠） 脑络欣通汤剂中的天然纳米颗粒
透析时间（10小时与12小时） 脑络欣通给药剂量（8.54 g/kg） 纳米颗粒给药剂量（81.15 mg/kg） MCAO手术造模及神经功能评分（Garcia评分1-2分） 给药方式：灌胃，每日两次，持续7天
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
从脑络欣通汤剂中分离出天然纳米颗粒（NLXT-NPs），并制备去除纳米颗粒的NLXT（NLXT-RN）和补充纳米颗粒的NLXT（NLXT-RN+NPs）以用于后续研究。
采用高速离心结合透析的方法分离NLXT-NPs。具体为：NLXT经3500 rpm离心10 min去除药渣，旋转蒸发浓缩至1.0 g·mL⁻¹，上清液过滤后以13,000 rpm离心30 min去除微米颗粒，取40 mL上清液加入透析袋（3500 Da），在600 r·min⁻¹磁力搅拌下用2000 mL去离子水透析10 h（每2小时更换外液），收集外液浓缩得到NLXT-RN，透析袋内液冻干得到NLXT-NPs冻干粉，按产量（0.19%±0.01%）将76.0 mg冻干粉加入NLXT-RN溶液中，37 °C水浴磁力搅拌1 h得到NLXT-RN+NPs。
表征NLXT-NPs的粒径分布、表面电荷、形态、化学组成和结构特征。
使用激光粒度分析仪测量粒径和Zeta电位；TEM和SEM观察形态；红外光谱分析结构特征；苯酚-硫酸法和考马斯亮蓝法测定多糖和蛋白质含量；UPLC-Q-TOF-MS分析化学成分，并通过MS/MS对人参皂苷Rg1、Rb1和黄芪甲苷IV进行裂解规律解析。
建立缺血性脑卒中大鼠模型，模拟临床缺血性脑卒中，用于评估NLXT及其纳米颗粒相关制剂的脑保护作用。
雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（220~240 g）随机分为6组：假手术组、MCAO模型组、NLXT组（8.54 g/kg）、NLXT-RN组（8.54 g/kg）、NLXT-RN+NPs组（8.54 g/kg）、NLXT-NPs组（81.15 mg/kg）。采用线栓法构建MCAO模型：3%戊巴比妥钠腹腔麻醉，分离左侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，插入线栓阻塞大脑中动脉，2小时后拔出线栓再灌注。假手术组仅分离血管，不插入线栓。造模后根据Garcia评分选择1-2分的大鼠，各给药组每日灌胃两次，连续7天；假手术组和模型组给予生理盐水（1 mL/100 g）。
评估各组大鼠神经功能缺损程度和脑组织梗死情况，以判断药物对脑损伤的改善作用。
给药结束后，根据自主运动、姿势对称性、前肢伸展、爬行、触觉反射和胡须触觉反射进行神经功能评分（NFS）。然后处死大鼠，取脑，于−20 °C冷冻30 min后切片，用2% TTC染色，4%多聚甲醛固定后拍照，通过Image J软件计算脑梗死体积百分比。
观察大脑皮层组织的病理学变化，评估各组大鼠脑组织损伤程度及药物干预的改善效果。
脑组织经脱水、石蜡包埋、切片后，用苏木精染色5分钟、1%水溶性伊红染色液染色2分钟，进行HE染色，然后在200倍视野下用倒置显微镜拍照观察。
评估各组大鼠脑组织中氧化应激水平的变化，以反映药物的抗氧化作用。
使用相应试剂盒测定超氧化物歧化酶（SOD）活性、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性和丙二醛（MDA）含量，按制造商说明书操作，用酶标仪在450 nm（SOD）、532 nm（MDA）或422 nm（GSH-Px）处测定吸光度。
评估各组大鼠脑组织中细胞凋亡水平，并检测凋亡相关蛋白Caspase-3/9的表达。
通过心脏灌注后取脑、固定、脱水、切片，进行TUNEL染色，在200倍镜下观察并计算凋亡率；同时使用相应试剂盒测定Caspase-3和Caspase-9的水平。
检测凋亡信号通路Bax/Bcl-2蛋白表达水平，以阐明NLXT及其纳米颗粒制剂抗凋亡的分子机制。
取梗死区域皮层组织约100 mg，液氮研磨后加入含有PMSF的RIPA裂解液（比例100:1），冰上裂解1 h，4 °C、12,000 rpm离心10 min，取上清，加入上样缓冲液，100 °C加热10 min变性。BCA法测定蛋白浓度，取40 µg蛋白/泳道进行10% SDS-PAGE电泳，转至PVDF膜，用5%脱脂牛奶室温封闭2 h，孵育一抗（Bcl-2、Bax、β-actin）4 °C过夜，洗涤后孵育二抗（1:3000）室温2 h，用ECL化学发光试剂盒显影，通过ImageJ软件定量，以β-actin作为内参。
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 材料 | 黄芪饮片（批号：200601） | -- | 200601 |
| 川芎饮片（批号：200601） | -- | 200601 | |
| 三七根及根茎饮片（批号：200601） | -- | 200601 | |
| 天麻饮片（批号：200601） | -- | 200601 | |
| 蜈蚣（批号：160801） | -- | 160801 | |
| 当归饮片（批号：200601） | -- | 200601 | |
| 红花饮片（批号：200601） | -- | 200601 | |
| Western blot | Bcl-2抗体（货号：bsm-33047M） | Bioss | bsm-33047M |
| Bax抗体（货号：bsm-33283M） | Bioss | bsm-33283M | |
| β-actin抗体（货号：bsm-33036M） | Bioss | bsm-33036M | |
| 氧化应激和凋亡检测 | SOD ELISA试剂盒（货号：A001-3-2） | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A001-3-2 |
| 氧化应激检测 | MDA ELISA试剂盒（货号：A003-1-2） | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A003-1-2 |
| GSH-Px ELISA试剂盒（货号：A005-1-2） | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A005-1-2 | |
| 凋亡检测 | Caspase-3 ELISA试剂盒（货号：G015-1-3） | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | G015-1-3 |
| Caspase-9 ELISA试剂盒（货号：G018-1-3） | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | G018-1-3 | |
| TUNEL凋亡检测试剂盒（货号：G002-1-2） | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | G002-1-2 | |
| 纳米颗粒表征 | ZEN 3690激光散射粒度分析仪 | Malvern Panalytical | -- |
| 透射电子显微镜HT7700 | Hitachi | -- | |
| 扫描电子显微镜Regulus8100 | Hitachi | -- | |
| 色谱分析 | Waters AcquityTM超高效液相色谱系统 | Waters Corporation | -- |
| Waters ACQUITY-CSH-C18色谱柱（2.1 mm × 100 mm, 1.7 μm） | Waters Corporation | -- | |
| 质谱分析 | Waters Xevo G2 Q/TOF质谱仪 | Waters Corporation | -- |
| 动物实验TTC染色 | TTC（货号：RS4130） | G-clone | RS4130 |
| 氧化应激检测 | 酶标仪Multiskan Spectrum | Thermo Fisher | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | Servicebio | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Servicebio | -- | |
| PVDF膜 | Servicebio | -- | |
| Tris缓冲液含0.2% Tween-20 | Servicebio | -- | |
| ECL化学发光试剂盒 | Servicebio | -- | |
| 超灵敏多功能成像仪Amersham Image 600 | Amersham | -- | |
| 数据统计 | SPSS 23 | -- | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 纳米颗粒分离条件 | 透析时间（10小时 vs 12小时）对纳米颗粒形态和组分的影响；离心转速和时间；透析袋截留分子量（3500 Da）。 阅读提示：见4.3节及2.1节图1C、D |
| MCAO模型构建 | 大鼠品系、性别、体重（雄性SD大鼠，220-240g）；麻醉方式（3%戊巴比妥钠1 mL/100g）；线栓插入深度；缺血2小时再灌注。 阅读提示：见4.7节 |
| 给药方案 | 给药剂量（NLXT相关组8.54 g/kg，NLXT-NPs组81.15 mg/kg）；给药频次（每日两次，持续7天）；给药途径（灌胃）。 阅读提示：见4.7节 |
| 神经功能评分及梗死体积 | Garcia评分标准；TTC染色时间（30 min）和温度（37°C）；固定条件（4%多聚甲醛4°C 24h）；梗死体积计算方法（ImageJ）。 阅读提示：见4.8节及表1 |
| 氧化应激检测 | SOD、MDA、GSH-Px的检测波长（450nm、532nm、422nm）；试剂盒货号。 阅读提示：见4.10节 |
| 凋亡及通路蛋白检测 | TUNEL染色步骤；Caspase-3/9检测；Western blot上样量（40 µg）；抗体稀释比例；内参（β-actin）。 阅读提示：见4.11、4.12节 |
