旋覆花(Calystegia soldanella)的二氯甲烷组分诱导HT-29人结直肠癌细胞S期阻滞和凋亡

Dichloromethane fractions of Calystegia soldanella induce S‑phase arrest and apoptosis in HT‑29 human colorectal cancer cells.

作者信息In-Hye Kim, Taekil Eom, Joon-Young Park, Hyung-Joo Kim, Taek-Jeong Nam
PMID34935054
发布时间2022-02
DOI10.3892/mmr.2021.12576

实验完整度

中

包含细胞活力、凋亡、线粒体膜电位、细胞周期及蛋白表达等体外实验,验证了凋亡和细胞周期阻滞机制,但缺乏体内实验。

主要模型

HT-29人结直肠癌细胞系

重点核对

DCM组分处理浓度:0-100 µg/ml DCM组分处理时间:24或48小时(细胞活力),20小时(凋亡、MMP、细胞周期) 细胞活力检测使用EZ-Cytox试剂盒 凋亡检测使用Annexin V和死细胞试剂盒 细胞周期检测使用Muse细胞周期试剂盒

摘要

旋覆花(Calystegia soldanella)是一种盐生植物,为多年生草本植物,生长于全球沿海沙丘。先前研究表明,该植物的提取物在人体中具有多种生物活性。然而,其对结直肠癌细胞的作用仍知之甚少。本研究探讨了旋覆花提取物在结直肠癌细胞系HT-29中的潜在生物活性。首先,通过有机溶剂萃取法从旋覆花粗提物中获得五个溶剂组分(正己烷、二氯甲烷(DCM)、乙酸乙酯、正丁醇和水)。其中,据细胞活力测定结果显示,DCM组分表现出显著的剂量和时间依赖性抑制作用。凋亡检测数据表明,DCM处理诱导的HT-29细胞活力抑制归因于凋亡增加。凋亡率呈剂量依赖性显著增加,这与凋亡相关蛋白的表达水平相关,包括Fas、Bad和Bax增加,以及pro-caspase-8、Bcl-2、Bcl-xL、pro-caspase-9、pro-caspase-7和pro-caspase-3减少。线粒体膜电位检测表明,经DCM处理的HT-29细胞中,更多细胞发生去极化,细胞色素c的释放程度呈剂量依赖性显著增加。此外,细胞周期分析证实DCM组分处理后发生S期阻滞,这与细胞周期相关蛋白(如cyclin A、CDK2、细胞分裂周期25 A和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1)表达水平降低有关。基于这些结果,本研究提示旋覆花提取物的DCM组分可通过线粒体膜电位调节和S期阻滞抑制HT-29细胞活力,同时诱导凋亡。这些结果也提示DCM组分在HT-29结直肠细胞中具有潜在的抗癌活性。对DCM组分的组成进行进一步研究是必要的。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
旋覆花提取物的溶剂组分对结直肠癌细胞HT-29的潜在生物活性及其机制。
核心机制
DCM组分通过调节凋亡相关蛋白(Fas、Bad、Bax增加,Bcl-2等减少)诱导外源性和内源性凋亡,并通过线粒体膜电位去极化和细胞色素c释放,以及诱导S期阻滞(cyclin A/CDK2/Cdc25A下调,p21上调)。
主要证据
细胞活力测定、Annexin V凋亡检测、线粒体膜电位检测、细胞周期分析及Western blotting证实了上述效应。
研究意义
DCM组分具有潜在抗癌活性,可能作为结直肠癌治疗的新策略,但需进一步研究其组成。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

提取与组分分离

获得不同溶剂组分,筛选具有生物活性的部分。

将旋覆花全株乙醇粗提物依次用正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇和水进行液-液分配,得到五个组分。

2

细胞活力筛选

评估各组分对HT-29细胞活力的影响,选择最有效组分。

用不同浓度的五个组分处理HT-29细胞24小时,检测细胞活力;随后用DCM组分处理24和48小时,检测剂量和时间依赖性效应。

3

凋亡检测

确定DCM组分诱导的细胞活力下降是否由凋亡引起。

用不同浓度DCM处理HT-29细胞20小时,使用Annexin V和死细胞试剂盒通过流式细胞术检测凋亡细胞比例。

4

凋亡相关蛋白表达分析

检测凋亡信号通路相关蛋白的表达变化。

用DCM处理细胞后,通过Western blotting检测Fas、pro-caspase-8、Bcl-2、Bcl-xL、Bad、Bax、pro-caspase-9、pro-caspase-7、pro-caspase-3、XIAP、cIAP-1、cIAP-2的表达。

5

线粒体膜电位检测

评估DCM组分对线粒体膜电位的影响。

用DCM处理HT-29细胞20小时,使用Muse MitoPotential试剂盒通过流式细胞术检测细胞去极化情况。

6

细胞周期分析

检查DCM组分是否影响细胞周期分布。

用DCM处理HT-29细胞20小时,使用Muse细胞周期试剂盒通过流式细胞术分析细胞周期阶段。

7

成分分析

鉴定DCM组分中的主要化合物。

使用UPLC-ESI-Q-TOF-MS分析DCM组分,鉴定主要酚酸和黄酮类化合物。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
乙醇----
正己烷----
乙酸乙酯----
正丁醇----
水----
RPMI-1640培养基Welgene, Inc.--
胎牛血清Welgene, Inc.--
青霉素-链霉素GenDEPOT, LLCCA005-10
EZ-Cytox试剂盒DoGenBio Co., Ltd.EZ-1000
FilterMAX F5酶标仪Molecular Devices LLC.--
光学显微镜Eclipse TS100-FNikon Corporation--
Muse膜联蛋白V和死细胞试剂盒Luminex CorporationMCH100105
Guava Muse细胞分析仪Luminex Corporation--
Muse线粒体膜电位试剂盒Luminex CorporationMCH100110
Muse细胞周期检测试剂盒Luminex CorporationMCH100106
M-PER哺乳动物蛋白提取试剂Thermo Fisher Scientific, Inc.78501
磷酸酶抑制剂混合物Thermo Fisher Scientific, Inc.1862495
ProteaseArrest蛋白酶抑制剂混合物G-Biosciences; Geno Technology, Inc.786-108
线粒体分离试剂盒Thermo Fisher Scientific, Inc.89874
BCA蛋白定量试剂盒Thermo Fisher Scientific, Inc.23225
PVDF膜MilliporeSigmaMLP.IPVH00010
牛血清白蛋白GenDEPOT, LLCA0100
WesternBright ECL HRP底物Advansta, Inc.K12045
GeneGnome 5成像系统Syngene75000
抗Fas抗体Santa Cruz Biotechnology, Inc.sc-7886
抗caspase-8抗体Santa Cruz Biotechnology, Inc.sc-7890
抗Bcl-2抗体Santa Cruz Biotechnology, Inc.sc-7382
抗Bcl-xL抗体Santa Cruz Biotechnology, Inc.sc-7195
抗Bad抗体Santa Cruz Biotechnology, Inc.sc-8044
抗Bax抗体Santa Cruz Biotechnology, Inc.sc-7480
抗caspase-9抗体Santa Cruz Biotechnology, Inc.sc-7885
抗caspase-7抗体Santa Cruz Biotechnology, Inc.sc-6138
抗caspase-3抗体Santa Cruz Biotechnology, Inc.sc-7148
抗XIAP抗体Cell Signaling Technology, Inc.2045
抗cIAP-1抗体Cell Signaling Technology, Inc.7065
抗cIAP-2抗体Cell Signaling Technology, Inc.3130
抗细胞色素c抗体Cell Signaling Technology, Inc.4272
抗COX IV抗体Cell Signaling Technology, Inc.4844
抗cyclin A抗体BIOSSBS-0571R
抗CDK2抗体Santa Cruz Biotechnology, Inc.sc-163
抗Cdc25A抗体Santa Cruz Biotechnology, Inc.sc-7389
抗p21抗体Santa Cruz Biotechnology, Inc.sc-271532
抗β-actin抗体Santa Cruz Biotechnology, Inc.sc-47778
HRP标记的抗小鼠IgGCell Signaling Technology, Inc.7076
HRP标记的抗兔IgGCell Signaling Technology, Inc.7074
Agilent Infinity 1260超高效液相色谱系统Agilent Technologies Deutschland GmbH--
Impact II四极杆飞行时间质谱仪Bruker Corporation--
Kintex核壳C-18色谱柱Phenomenex--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
细胞培养
HT-29细胞系来源和STR鉴定、培养基、FBS浓度、青霉素/链霉素浓度、培养条件(37°C,5% CO2)
阅读提示:Materials and methods, Cell culture
细胞活力检测
细胞接种密度、处理浓度和时间、检测试剂盒、检测波长和读数时间
阅读提示:Materials and methods, Cell viability assays and Figure 1
凋亡检测
处理浓度和时间、染色试剂盒、细胞密度、孵育时间
阅读提示:Materials and methods, Apoptosis assay and Figure 2
线粒体膜电位检测
处理浓度和时间、MitoPotential试剂盒、孵育条件和读数
阅读提示:Materials and methods, Assessment of MMP and Figure 4A
细胞周期分析
处理浓度和时间、固定和染色步骤、细胞密度
阅读提示:Materials and methods, Cell cycle assay and Figure 5A
蛋白表达分析
处理浓度和时间、裂解缓冲液、抗体稀释比例、蛋白上样量、检测系统
阅读提示:Materials and methods, Western blotting and Figures 3, 4B, 5B