提取与组分分离
获得不同溶剂组分,筛选具有生物活性的部分。
将旋覆花全株乙醇粗提物依次用正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇和水进行液-液分配,得到五个组分。
Dichloromethane fractions of Calystegia soldanella induce S‑phase arrest and apoptosis in HT‑29 human colorectal cancer cells.
包含细胞活力、凋亡、线粒体膜电位、细胞周期及蛋白表达等体外实验,验证了凋亡和细胞周期阻滞机制,但缺乏体内实验。
HT-29人结直肠癌细胞系
DCM组分处理浓度:0-100 µg/ml DCM组分处理时间:24或48小时(细胞活力),20小时(凋亡、MMP、细胞周期) 细胞活力检测使用EZ-Cytox试剂盒 凋亡检测使用Annexin V和死细胞试剂盒 细胞周期检测使用Muse细胞周期试剂盒
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
获得不同溶剂组分,筛选具有生物活性的部分。
将旋覆花全株乙醇粗提物依次用正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇和水进行液-液分配,得到五个组分。
评估各组分对HT-29细胞活力的影响,选择最有效组分。
用不同浓度的五个组分处理HT-29细胞24小时,检测细胞活力;随后用DCM组分处理24和48小时,检测剂量和时间依赖性效应。
确定DCM组分诱导的细胞活力下降是否由凋亡引起。
用不同浓度DCM处理HT-29细胞20小时,使用Annexin V和死细胞试剂盒通过流式细胞术检测凋亡细胞比例。
检测凋亡信号通路相关蛋白的表达变化。
用DCM处理细胞后,通过Western blotting检测Fas、pro-caspase-8、Bcl-2、Bcl-xL、Bad、Bax、pro-caspase-9、pro-caspase-7、pro-caspase-3、XIAP、cIAP-1、cIAP-2的表达。
评估DCM组分对线粒体膜电位的影响。
用DCM处理HT-29细胞20小时,使用Muse MitoPotential试剂盒通过流式细胞术检测细胞去极化情况。
检查DCM组分是否影响细胞周期分布。
用DCM处理HT-29细胞20小时,使用Muse细胞周期试剂盒通过流式细胞术分析细胞周期阶段。
鉴定DCM组分中的主要化合物。
使用UPLC-ESI-Q-TOF-MS分析DCM组分,鉴定主要酚酸和黄酮类化合物。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 萃取 | 乙醇 | -- | -- |
| 正己烷 | -- | -- | |
| 乙酸乙酯 | -- | -- | |
| 正丁醇 | -- | -- | |
| 水 | -- | -- | |
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Welgene, Inc. | -- |
| 胎牛血清 | Welgene, Inc. | -- | |
| 青霉素-链霉素 | GenDEPOT, LLC | CA005-10 | |
| 细胞活力 | EZ-Cytox试剂盒 | DoGenBio Co., Ltd. | EZ-1000 |
| FilterMAX F5酶标仪 | Molecular Devices LLC. | -- | |
| 光学显微镜Eclipse TS100-F | Nikon Corporation | -- | |
| 凋亡 | Muse膜联蛋白V和死细胞试剂盒 | Luminex Corporation | MCH100105 |
| Guava Muse细胞分析仪 | Luminex Corporation | -- | |
| MMP | Muse线粒体膜电位试剂盒 | Luminex Corporation | MCH100110 |
| 细胞周期 | Muse细胞周期检测试剂盒 | Luminex Corporation | MCH100106 |
| 蛋白提取 | M-PER哺乳动物蛋白提取试剂 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 78501 |
| 磷酸酶抑制剂混合物 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 1862495 | |
| ProteaseArrest蛋白酶抑制剂混合物 | G-Biosciences; Geno Technology, Inc. | 786-108 | |
| 线粒体分离 | 线粒体分离试剂盒 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 89874 |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 23225 |
| Western blotting | PVDF膜 | MilliporeSigma | MLP.IPVH00010 |
| 牛血清白蛋白 | GenDEPOT, LLC | A0100 | |
| WesternBright ECL HRP底物 | Advansta, Inc. | K12045 | |
| GeneGnome 5成像系统 | Syngene | 75000 | |
| 抗Fas抗体 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-7886 | |
| 抗caspase-8抗体 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-7890 | |
| 抗Bcl-2抗体 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-7382 | |
| 抗Bcl-xL抗体 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-7195 | |
| 抗Bad抗体 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-8044 | |
| 抗Bax抗体 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-7480 | |
| 抗caspase-9抗体 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-7885 | |
| 抗caspase-7抗体 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-6138 | |
| 抗caspase-3抗体 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-7148 | |
| 抗XIAP抗体 | Cell Signaling Technology, Inc. | 2045 | |
| 抗cIAP-1抗体 | Cell Signaling Technology, Inc. | 7065 | |
| 抗cIAP-2抗体 | Cell Signaling Technology, Inc. | 3130 | |
| 抗细胞色素c抗体 | Cell Signaling Technology, Inc. | 4272 | |
| 抗COX IV抗体 | Cell Signaling Technology, Inc. | 4844 | |
| 抗cyclin A抗体 | BIOSS | BS-0571R | |
| 抗CDK2抗体 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-163 | |
| 抗Cdc25A抗体 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-7389 | |
| 抗p21抗体 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-271532 | |
| 抗β-actin抗体 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-47778 | |
| HRP标记的抗小鼠IgG | Cell Signaling Technology, Inc. | 7076 | |
| HRP标记的抗兔IgG | Cell Signaling Technology, Inc. | 7074 | |
| UPLC-ESI-Q-TOF-MS | Agilent Infinity 1260超高效液相色谱系统 | Agilent Technologies Deutschland GmbH | -- |
| Impact II四极杆飞行时间质谱仪 | Bruker Corporation | -- | |
| Kintex核壳C-18色谱柱 | Phenomenex | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | HT-29细胞系来源和STR鉴定、培养基、FBS浓度、青霉素/链霉素浓度、培养条件(37°C,5% CO2) 阅读提示:Materials and methods, Cell culture |
| 细胞活力检测 | 细胞接种密度、处理浓度和时间、检测试剂盒、检测波长和读数时间 阅读提示:Materials and methods, Cell viability assays and Figure 1 |
| 凋亡检测 | 处理浓度和时间、染色试剂盒、细胞密度、孵育时间 阅读提示:Materials and methods, Apoptosis assay and Figure 2 |
| 线粒体膜电位检测 | 处理浓度和时间、MitoPotential试剂盒、孵育条件和读数 阅读提示:Materials and methods, Assessment of MMP and Figure 4A |
| 细胞周期分析 | 处理浓度和时间、固定和染色步骤、细胞密度 阅读提示:Materials and methods, Cell cycle assay and Figure 5A |
| 蛋白表达分析 | 处理浓度和时间、裂解缓冲液、抗体稀释比例、蛋白上样量、检测系统 阅读提示:Materials and methods, Western blotting and Figures 3, 4B, 5B |