KSHV生产及感染性分析
评估在裂解复制期间添加DMSO对KSHV病毒产量和感染性的影响。
在诱导裂解复制时,用不同浓度DMSO处理iSLK BAC16细胞,提取病毒,感染HUVECs,通过GFP表达和流式细胞术分析感染率。
Dimethyl Sulfoxide Enhances Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus Production During Lytic Replication.
包含细胞系模型(iSLK BAC16、BCBL-1),功能验证(病毒产量、感染性),机制验证(信号通路、抑制剂、siRNA),以及时间动力学分析。
iSLK BAC16细胞 BCBL-1细胞 HUVECs
DMSO浓度:0.1%、0.5%、1% 诱导条件:1.2 mM丁酸钠和50 μg/mL多西环素 病毒感染:5 μg/mL聚凝胺 实验重复:n=3
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估在裂解复制期间添加DMSO对KSHV病毒产量和感染性的影响。
在诱导裂解复制时,用不同浓度DMSO处理iSLK BAC16细胞,提取病毒,感染HUVECs,通过GFP表达和流式细胞术分析感染率。
探究DMSO对KSHV裂解和潜伏基因表达的影响。
在DMSO处理期间,提取RNA和蛋白质,通过RT-qPCR和Western blot分析病毒基因表达。
确定DMSO是否加速病毒产生或仅增加产量。
在不同时间点(1-4天)分析病毒蛋白表达和感染性。
确定DMSO增强裂解复制的信号通路。
通过Western blot检测信号蛋白磷酸化,使用JNK抑制剂SP600125和JNK siRNA验证JNK通路的作用。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM高糖培养基 | Welgene | -- |
| 胎牛血清 | GenDEPOT | -- | |
| 抗生素-抗真菌剂 | Invitrogen | -- | |
| 潮霉素B | Invitrogen | -- | |
| G418 | Invitrogen | -- | |
| 嘌呤霉素 | Invitrogen | -- | |
| 病毒诱导 | 丁酸钠 | Sigma | -- |
| 多西环素 | Sigma | -- | |
| 药物处理 | SP600125 | Calbiochem | -- |
| 二甲基亚砜 | LPS Solution | -- | |
| 病毒感染 | 聚凝胺 | Santa Cruz Biotechnology | -- |
| Western blot | Clarity Western ECL底物 | Bio-Rad Laboratories | -- |
| Amersham ImageQuant 800成像仪 | GE Healthcare | -- | |
| RNA提取 | Ribospin II RNA提取试剂盒 | GeneAll Biotechnology | -- |
| cDNA合成 | PrimeScript RT预混液 | Takara | -- |
| qPCR | TB Green FAST qPCR预混液 | Takara | -- |
| CFX96实时荧光定量PCR仪 | Bio-Rad Laboratories | -- | |
| 流式细胞术 | Guava easyCyte流式细胞仪 | Luminex Corporation | -- |
| DNA提取 | DNeasy血液和组织试剂盒 | Qiagen | -- |
| LDH检测 | 细胞毒性检测试剂盒PLUS | Roche | -- |
| siRNA转染 | Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Western blot | HHV8 ORF50抗体 | Bioss | bs-0860R |
| 总AKT抗体 | Bioss | bs-5050R | |
| 总p38 MAPK抗体 | Bioss | bs-50503R | |
| 磷酸化p38 MAPK抗体 | Bioss | bs-50486R | |
| 磷酸化ERK抗体 | Bioss | bs-50534R | |
| HHV-8 K8.1A/B抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-65446 | |
| JNK抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7345 | |
| 磷酸化JNK抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-6254 | |
| β-肌动蛋白抗体 | Sigma | A-1978 | |
| KSHV ORF45抗体 | Invitrogen | MA5-14769 | |
| KSHV ORF65抗体 | -- | -- | |
| HHV8 LANA抗体 | Abcam | ab4103 |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 培养基成分、浓度(如DMEM、FBS、抗生素) 阅读提示:Materials and Methods, 细胞培养与试剂 |
| 病毒诱导 | 诱导剂浓度(丁酸钠、多西环素)及时间 阅读提示:Materials and Methods, 病毒分离与感染 |
| DMSO处理 | DMSO浓度范围及处理时间 阅读提示:Results, 图1-3 |
| 病毒感染 | 感染时聚凝胺浓度、离心条件 阅读提示:Materials and Methods, 病毒分离与感染 |
| 信号通路抑制 | SP600125浓度、siRNA转染浓度 阅读提示:Materials and Methods, 敲低JNK |