二甲基亚砜在裂解复制期间增强卡波西肉瘤相关疱疹病毒的产量

Dimethyl Sulfoxide Enhances Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus Production During Lytic Replication.

作者信息Su-Kyung Kang, Myung-Ju Lee, Ho-Hyun Ryu, Jisu Lee, Myung-Shin Lee
PMID34975802
发布时间2021-12-16
DOI10.3389/fmicb.2021.778525

实验完整度

高

包含细胞系模型(iSLK BAC16、BCBL-1),功能验证(病毒产量、感染性),机制验证(信号通路、抑制剂、siRNA),以及时间动力学分析。

主要模型

iSLK BAC16细胞 BCBL-1细胞 HUVECs

重点核对

DMSO浓度:0.1%、0.5%、1% 诱导条件:1.2 mM丁酸钠和50 μg/mL多西环素 病毒感染:5 μg/mL聚凝胺 实验重复:n=3

摘要

卡波西肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)是卡波西肉瘤、原发性渗出性淋巴瘤和多中心Castleman病的病原体。在KSHV研究中,高效病毒生产和分离至关重要。KSHV的再激活可通过用化学物质(如12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯和丁酸钠)处理潜伏感染的细胞来启动。这些化学物质已被用作工具,在KSHV生产细胞系中诱导裂解复制和病毒生产。二甲基亚砜(DMSO)是一种有机硫化合物,常用作类似水的非质子溶剂。在探索KSHV感染细胞信号通路的实验中,单独使用DMSO作为载体影响了KSHV裂解基因的表达。然而,据我们所知,DMSO对KSHV生产细胞的影响尚未见报道。因此,在本研究中,我们调查了DMSO是否可作为增强KSHV生产细胞裂解复制期间病毒产量的试剂,并评估了其潜在机制。DMSO对KSHV产量的影响在iSLK BAC16细胞中进行了分析,该细胞广泛用于重组KSHV的生产。我们发现,在诱导裂解复制期间,用DMSO处理可显著增加KSHV病毒粒子的产量。机制上,DMSO处理增强了KSHV裂解基因的表达,这与病毒粒子产量相关。此外,DMSO在裂解复制期间诱导JNK磷酸化,抑制JNK可消除DMSO对裂解复制和病毒产量的影响。我们的研究结果表明,在诱导裂解复制期间额外添加DMSO可显著提高KSHV产量。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
DMSO是否能在裂解复制期间增强KSHV生产细胞中的病毒产量,其潜在机制是什么?
核心机制
DMSO通过诱导JNK磷酸化增强KSHV裂解复制,从而增加病毒基因表达和病毒粒子产量。
主要证据
在iSLK BAC16细胞中,DMSO处理显著增加KSHV病毒粒子产量和感染性,同时增强裂解基因表达;JNK抑制剂SP600125或siRNA敲低JNK可阻断DMSO的增强作用。
研究意义
该发现为需要大量KSHV病毒粒子的研究提供了一种更有效的病毒制备方法。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

KSHV生产及感染性分析

评估在裂解复制期间添加DMSO对KSHV病毒产量和感染性的影响。

在诱导裂解复制时,用不同浓度DMSO处理iSLK BAC16细胞,提取病毒,感染HUVECs,通过GFP表达和流式细胞术分析感染率。

2

病毒基因表达分析

探究DMSO对KSHV裂解和潜伏基因表达的影响。

在DMSO处理期间,提取RNA和蛋白质,通过RT-qPCR和Western blot分析病毒基因表达。

3

时间动力学分析

确定DMSO是否加速病毒产生或仅增加产量。

在不同时间点(1-4天)分析病毒蛋白表达和感染性。

4

信号通路机制研究

确定DMSO增强裂解复制的信号通路。

通过Western blot检测信号蛋白磷酸化,使用JNK抑制剂SP600125和JNK siRNA验证JNK通路的作用。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

病毒生产与感染
细胞活性分析

产品清单

实验环节名称品牌货号
DMEM高糖培养基Welgene--
胎牛血清GenDEPOT--
抗生素-抗真菌剂Invitrogen--
潮霉素BInvitrogen--
G418Invitrogen--
嘌呤霉素Invitrogen--
丁酸钠Sigma--
多西环素Sigma--
SP600125Calbiochem--
二甲基亚砜LPS Solution--
聚凝胺Santa Cruz Biotechnology--
Clarity Western ECL底物Bio-Rad Laboratories--
Amersham ImageQuant 800成像仪GE Healthcare--
Ribospin II RNA提取试剂盒GeneAll Biotechnology--
PrimeScript RT预混液Takara--
TB Green FAST qPCR预混液Takara--
CFX96实时荧光定量PCR仪Bio-Rad Laboratories--
Guava easyCyte流式细胞仪Luminex Corporation--
DNeasy血液和组织试剂盒Qiagen--
细胞毒性检测试剂盒PLUSRoche--
Lipofectamine RNAiMAX转染试剂Thermo Fisher Scientific--
HHV8 ORF50抗体Biossbs-0860R
总AKT抗体Biossbs-5050R
总p38 MAPK抗体Biossbs-50503R
磷酸化p38 MAPK抗体Biossbs-50486R
磷酸化ERK抗体Biossbs-50534R
HHV-8 K8.1A/B抗体Santa Cruz Biotechnologysc-65446
JNK抗体Santa Cruz Biotechnologysc-7345
磷酸化JNK抗体Santa Cruz Biotechnologysc-6254
β-肌动蛋白抗体SigmaA-1978
KSHV ORF45抗体InvitrogenMA5-14769
KSHV ORF65抗体----
HHV8 LANA抗体Abcamab4103

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
细胞培养
培养基成分、浓度(如DMEM、FBS、抗生素)
阅读提示:Materials and Methods, 细胞培养与试剂
病毒诱导
诱导剂浓度(丁酸钠、多西环素)及时间
阅读提示:Materials and Methods, 病毒分离与感染
DMSO处理
DMSO浓度范围及处理时间
阅读提示:Results, 图1-3
病毒感染
感染时聚凝胺浓度、离心条件
阅读提示:Materials and Methods, 病毒分离与感染
信号通路抑制
SP600125浓度、siRNA转染浓度
阅读提示:Materials and Methods, 敲低JNK