粪便代谢物对结直肠癌细胞生长的影响
评估健康与肿瘤小鼠及人类粪便代谢物对CRC细胞增殖和死亡的作用。
从野生型、SingleMut、DoubleMut、TripleMut小鼠及健康人和CRC患者粪便中提取代谢物，处理HCT116、SW480、DLD1、RKO细胞，检测增殖、集落形成和LDH释放。
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健康肠道微生物组中的罗伊氏菌素通过改变氧化还原平衡抑制结直肠癌生长
Reuterin in the healthy gut microbiome suppresses colorectal cancer growth through altering redox balance.
实验完整度
高包含体外细胞实验、类器官培养、小鼠遗传模型（Apc/Trp53/Kras突变）和移植瘤模型，并整合代谢组学、转录组学、蛋白质组学等多组学验证，明确功能与机制验证。
主要模型
HCT116、SW480、RKO、DLD1 结直肠癌细胞系 TripleMut（Apc/Trp53/Kras）小鼠结肠肿瘤模型 HCT116/SW480 皮下异种移植瘤模型 MC38 同系小鼠肿瘤模型
重点核对
L. reuteri 野生型与突变株（ΔpduC）的区分及每日灌胃剂量（2×10^9 CFU/mL） 粪便代谢物提取方法（甲醇/氯仿）及处理浓度（100X） 罗伊氏菌素处理浓度（25–100 μM）及时间（24–72小时） NAC、谷胱甘肽乙酯、BSO 等氧化还原调节剂的使用 体内实验中肿瘤体积、ROS（DCFDA）、蛋白质翻译（嘌呤霉素掺入）的检测
摘要
微生物失调是结直肠癌（CRC）的一个标志，并促进炎症、肿瘤生长和治疗反应。肠道微生物通过代谢物发出信号，但代谢物如何影响CRC在很大程度上是未知的。我们研究了与具有不同突变负荷的结肠肿瘤发生小鼠模型相关的粪便代谢物。我们发现来自健康小鼠或人类的微生物代谢物具有生长抑制作用，而这种反应在小鼠和CRC患者中减弱。微生物分析显示，罗伊氏乳杆菌及其代谢物罗伊氏菌素在小鼠和人类CRC中下调。罗伊氏菌素改变氧化还原平衡，并减少结肠癌细胞的增殖和存活。罗伊氏菌素诱导选择性蛋白质氧化，并抑制核糖体生物发生和蛋白质翻译。外源性罗伊氏乳杆菌限制结肠肿瘤生长，增加肿瘤活性氧，并在体内减少蛋白质翻译。我们的发现表明，健康的微生物组，特别是罗伊氏乳杆菌，通过微生物代谢物交换对CRC具有保护作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 健康肠道微生物组通过代谢物交换抑制结直肠癌生长的机制是什么？
- 核心机制
- 罗伊氏菌素通过诱导氧化应激（ROS升高、谷胱甘肽耗竭）和选择性蛋白质氧化，抑制核糖体生物发生和蛋白质翻译，从而抑制肿瘤生长。
- 主要证据
- 体外细胞实验显示罗伊氏菌素抑制生长并诱导ROS；多组学分析鉴定谷胱甘肽代谢和核糖体通路；体内实验中野生型L. reuteri增加肿瘤ROS、降低翻译并延长生存期。
- 研究意义
- 研究提示L. reuteri及其代谢物罗伊氏菌素作为潜在的益生菌策略，用于结直肠癌的预防或辅助治疗，并强调精准益生菌的潜力。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
微生物组分析和L. reuteri丰度检测
分析不同肿瘤阶段小鼠及人类CRC中微生物群落的变化，特别是L. reuteri的丰度。
对小鼠粪便和肿瘤黏膜进行16S rRNA测序，通过qPCR定量L. reuteri，并在人类样本中验证。
罗伊氏菌素的体外细胞活性验证
确定罗伊氏菌素对多种癌细胞系和正常细胞的生长抑制及细胞毒性作用。
用不同浓度罗伊氏菌素处理结直肠癌细胞系（HCT116, SW480, RKO, DLD1）及正常细胞，测定生长曲线、集落形成、LDH释放和类器官细胞死亡。
多组学分析揭示氧化应激和蛋白质翻译抑制
阐明罗伊氏菌素作用的分子机制，特别是氧化应激和核糖体生物发生。
对罗伊氏菌素处理的细胞进行RNA-seq、代谢组学和蛋白质组学（包括半胱氨酸活性蛋白质组学）分析，并检测ROS、谷胱甘肽水平和蛋白质翻译（嘌呤霉素掺入）。
体内验证L. reuteri和罗伊氏菌素的抗肿瘤作用
评估野生型L. reuteri（产罗伊氏菌素）在移植瘤和遗传小鼠模型中对肿瘤生长、ROS和生存的影响。
在裸鼠皮下植入HCT116/SW480细胞，或同系MC38模型，每日灌胃野生型或突变型L. reuteri；在TripleMut小鼠中每日灌胃，监测肿瘤大小、ROS、翻译、生存和组织病理。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| Western blot | HIF-2α抗体 | Bethyl Laboratories | Cat# 179483 |
| 免疫组织化学 | Ki67抗体 | Cell Signaling | Cat#12202T |
| Western blot | 肌动蛋白抗体 | Protein Tech | Cat# 60008-1-Ig |
| 免疫组织化学 | 活化型半胱天冬酶3 | Cell Signaling | Cat#9661T |
| Western blot | 嘌呤霉素抗体 | Developmental Studies Hybridoma Bank | Cat# PMY-2A4 |
| 免疫组织化学 | 4-HNE抗体 | Bioss Antibodies | Cat# BS-6313R |
| Western blot | 磷酸化组蛋白H2A抗体 | Sigma | Cat#ZMS05636 |
| 药物处理 | FG-4592 | Cayman Chemical | Cat#15294 |
| N-乙酰半胱氨酸 | Cayman Chemical | Cat#20261 | |
| 胱硫醚 | Cayman Chemical | Cat# 16061 | |
| 奥拉帕尼 | Cayman Chemical | Cat#10621 | |
| CX-5461 | Cayman Chemical | Cat#18392 | |
| 培养基补充物 | L-苏氨酸 | Sigma | Cat# 72-19-5 |
| 氯化铵 | Sigma | Cat#213330 | |
| 药物处理 | 5-氟尿嘧啶 | Sigma | Cat#F6627 |
| 培养基补充物 | 左卡尼汀 | Sigma | Cat#21489 |
| 天冬氨酸 | Sigma | Cat#1043819 | |
| L-谷氨酸 | Sigma | Cat#G1251 | |
| L-谷氨酰胺 | Sigma | Cat#G8540 | |
| 药物处理 | 过氧化氢 | Sigma | Cat#HX0636 |
| L-丁硫氨酸-亚砜亚胺 | Cayman Chemical | Cat#14484 | |
| 谷胱甘肽乙酯 | Cayman Chemnical | Cat#14953 | |
| 培养基补充物 | 乳清酸 | Sigma | Cat#O2750 |
| 脲基琥珀酸 | Cayman Chemical | Cat#34126 | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| MRS肉汤 | -- | -- | |
| LB肉汤 | -- | -- | |
| 代谢物提取 | 甲醇 | -- | -- |
| 氯仿 | -- | -- | |
| RNA提取 | Trizol试剂 | -- | -- |
| RT-qPCR | SuperScript III第一链合成系统 | Invitrogen | -- |
| SYBR Green预混液 | -- | -- | |
| Western blot | RIPA裂解缓冲液 | -- | -- |
| LDH assay | LDH细胞毒性检测试剂盒 | Takara Bio | -- |
| ROS检测 | 羧基-H2DCFDA | Invitrogen | -- |
| 脂质ROS检测 | C11-BODIPY | ThermoFisher | -- |
| 蛋白质合成检测 | 嘌呤霉素 | -- | -- |
| 细胞分离 | IV型胶原酶 | -- | -- |
| EDTA | -- | -- | |
| 免疫细胞分离 | Percoll | -- | -- |
| 组织学 | 福尔马林 | -- | -- |
| Permount封片剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 免疫组织化学 | DAB底物 | -- | -- |
| 免疫荧光 | 含DAPI的Prolong Gold抗淬灭封片剂 | -- | -- |
| 蛋白质组学 | Orbitrap Fusion Lumos质谱仪 | -- | -- |
| Proxeon NanoLC-1200超高效液相色谱系统 | -- | -- | |
| 16S测序 | MiSeq V2 500循环试剂盒 | Illumina | -- |
| 细胞活力检测 | MTT试剂 | -- | -- |
| 活细胞成像 | Cytation 5多功能成像读板仪 | -- | -- |
| RT-qPCR | QuantStudio 5实时荧光定量PCR系统 | Applied BioSystems | -- |
| Western blot | ChemiDoc成像系统 | BioRad | -- |
| 流式细胞术 | Beckman Coulter MoFlo Astrios流式细胞仪 | -- | -- |
| 代谢组学 | Agilent MassHunter工作站定量分析软件 | Agilent | -- |
| HP5 ms 5%苯基甲基聚硅氧烷毛细管气相色谱柱 | Agilent | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 粪便代谢物提取 | 提取溶剂（甲醇/氯仿比例）、离心速度和时间、干燥方式、复溶溶剂 阅读提示：STAR Methods 中 Metabolite Extraction 小节 |
| 细胞增殖实验 | 细胞系、接种密度、处理浓度（如100X粪便代谢物、25-100μM reuterin）、处理时间、检测方法（MTT或活细胞成像） 阅读提示：STAR Methods 中 Proliferation Assay 部分及图1、3图注 |
| L. reuteri 培养与灌胃 | 菌株（ATCC PTA6475 和 PRB94）、培养条件（MRS肉汤、37°C）、灌胃剂量（2×10^9 CFU/mL）、频率（每日） 阅读提示：STAR Methods 中 Bacterial Strains 和 Mouse 部分 |
| 体内肿瘤模型 | 小鼠品系（裸鼠、C57Bl/6J）、细胞系（HCT116、SW480、MC38）及注射数量（2百万）、肿瘤起始时间、治疗开始时间（第10天） 阅读提示：STAR Methods 中 Syngeneic and Xenograft Studies 部分 |
| 蛋白质翻译检测 | 嘌呤霉素浓度（1 mg/mL）、孵育时间（体外10分钟，体内30分钟）、裂解和Western blot方法 阅读提示：STAR Methods 中 Puromycin Assay 部分 |
| ROS检测 | 探针（carboxy-H2DCFDA）、浓度（10μM）、孵育时间（45分钟）、细胞处理条件（reuterin浓度和时间） 阅读提示：STAR Methods 中 ROS Detection Assay 部分 |