脱细胞牛颈动脉的制备与验证
获得无细胞、保留细胞外基质的血管支架,并确认脱细胞效果和基质完整性。
牛颈动脉经物理和化学处理脱细胞,包括去离子水洗涤、酶消化、去垢剂和DNA酶处理;通过H&E染色确认无细胞核,免疫组化染色显示层粘连蛋白和胶原IV保留。
Surface modification of decellularized bovine carotid arteries with human vascular cells significantly reduces their thrombogenicity.
包含体外细胞接种、动态培养、体外全血灌注、组织学和免疫组化验证,但缺乏体内实验和功能机制验证。
脱细胞牛颈动脉移植物 人内皮祖细胞(hECPC) 人脐带间充质干细胞(hMSC)
管腔内皮细胞覆盖率(LECC) > 50% 全血灌注时间2小时,流速6 ml/min 血小板计数变化(主要终点) 葡萄糖和乳酸水平作为非侵入性覆盖率指标 肝素涂层和低剂量肝素化(5 U/ml)
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
获得无细胞、保留细胞外基质的血管支架,并确认脱细胞效果和基质完整性。
牛颈动脉经物理和化学处理脱细胞,包括去离子水洗涤、酶消化、去垢剂和DNA酶处理;通过H&E染色确认无细胞核,免疫组化染色显示层粘连蛋白和胶原IV保留。
在脱细胞移植物管腔表面建立内皮细胞单层,以实现生理性覆盖。
将hECPC和hMSC共接种到dBCA上,采用动态接种和静态培养,随后进行动态培养以逐渐增加剪切应力。
模拟生理血流条件,促进细胞成熟和内皮化。
使用生物反应器进行动态培养,逐步增加流速;通过计算流体动力学模拟壁剪切应力。
评估再细胞化和脱细胞移植物的血栓形成性。
将再细胞化(LECC>50%)和脱细胞移植物置于闭合环路灌注系统中,用人全血灌注2小时,定期检测溶血和血细胞计数,并进行组织学分析。
验证非侵入性代谢指标能否预测内皮覆盖率。
动态培养期间每日测量葡萄糖和乳酸水平,与最终LECC进行相关性分析,并通过ROC曲线确定最佳阈值。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 脱细胞处理 | 胰蛋白酶 | Sigma-Aldrich | -- |
| Triton X-100 | Roth | -- | |
| DNA酶I | Roche Diagnostics | -- | |
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | Biochrom GmbH | -- |
| 内皮基础培养基-2 | PromoCell GmbH | -- | |
| 胎牛血清 | Biochrom GmbH | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Biochrom GmbH | -- | |
| 明胶 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 谷氨酰胺 | Biochrom GmbH | -- | |
| 肝素 | -- | -- | |
| 组织学 | 石蜡 | Sigma-Aldrich / Merck | -- |
| 免疫组化 | 抗层粘连蛋白抗体 | Abcam | ab11575 |
| 抗I型胶原抗体 | Abcam | ab6308 | |
| 抗IV型胶原抗体 | Abcam | ab6586 | |
| 抗CD34抗体 | Abcam | ab110643 | |
| 抗CD31抗体 | Bioss Antibodies Inc. | bs-0195R | |
| 抗eNOS抗体 | Abcam | ab5589 | |
| 抗血管性血友病因子抗体 | Abcam | ab6994 | |
| 抗CD90抗体 | Abcam | ab52625 | |
| 山羊抗兔IgG二抗(Alexa Fluor 594) | Abcam | ab150080 | |
| Dako LSAB2系统-HRP | Agilent Technologies | K0675 | |
| 封片剂 | Merck | -- | |
| 抗CD41抗体 | Abcam | ab63983 | |
| 抗CD45抗体 | Leica Biosystems | -- | |
| 全血灌注系统 | Corline肝素偶联物 | Corline Biomedical | -- |
| 分析仪器 | 蔡司Axio Observer.Z1显微镜 | Carl Zeiss AG | -- |
| ABL 800血气分析仪 | Radiometer | -- | |
| NanoDrop 2000 C紫外-可见分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 脱细胞 | 脱细胞方法:0.05% Trypsin/0.02% EDTA、0.1% Triton X-100、DNAse-I处理循环次数和时间 阅读提示:Methods 中 Decellularization of bovine carotid arteries (dBCA) |
| 细胞培养 | hECPC和hMSC的来源、培养基组成、细胞代次(hECPC P3-P6,hMSC P3-P7) 阅读提示:Methods 中 Cell isolation, expansion and culture |
| 再细胞化 | 细胞接种密度(hECPC和hMSC数量)、比例(2:1)、接种流速(40 ml/h)、每轮时间(3小时)和轮数(8轮) 阅读提示:Methods 中 Dynamic seeding and static culture of hECPC and hMSC |
| 动态培养 | 动态培养时间(10天 vs 14天)、流速逐步增加(0.6-8 ml/min)、剪切应力范围(0.0033-0.033 dynes/cm²) 阅读提示:Results 中 Cell viability and proliferation during dynamic culture 和 Fig. 2 |
| 全血灌注 | 灌注时间(2小时)、流速(6 ml/min)、肝素浓度(5 U/ml)、血小板计数评估时间点(t0, t1, t2) 阅读提示:Methods 中 Ex vivo whole blood perfusion of vascular grafts 和 Fig. 6 |