用人类血管细胞对脱细胞牛颈动脉进行表面修饰可显著降低其血栓形成性

Surface modification of decellularized bovine carotid arteries with human vascular cells significantly reduces their thrombogenicity.

作者信息Eriselda Keshi, Peter Tang, Marie Weinhart, Hannah Everwien, Simon Moosburner, Nicolai Seiffert, Michael Lommel, Ulrich Kertzscher, Brigitta Globke, Anja Reutzel-Selke, Benjamin Strücker, Johann Pratschke, Igor Maximillian Sauer, Nils Haep, Karl Herbert Hillebrandt
PMID34819102
发布时间2021-11-24
DOI10.1186/s13036-021-00277-2

实验完整度

包含体外细胞接种、动态培养、体外全血灌注、组织学和免疫组化验证,但缺乏体内实验和功能机制验证。

主要模型

脱细胞牛颈动脉移植物 人内皮祖细胞(hECPC) 人脐带间充质干细胞(hMSC)

重点核对

管腔内皮细胞覆盖率(LECC) > 50% 全血灌注时间2小时,流速6 ml/min 血小板计数变化(主要终点) 葡萄糖和乳酸水平作为非侵入性覆盖率指标 肝素涂层和低剂量肝素化(5 U/ml)

摘要

背景:由于在血管手术中超过20%的病例需要自体静脉但无法获取,生产用于植入的个性化生物血管移植物变得至关重要。用血管细胞对脱细胞异种移植物进行表面修饰,以实现生理性管腔覆盖并最终获得抗血栓性,是植入的重要前提。然而,由于多种原因,体外血栓形成性测试在血管移植物组织工程领域仍然是一个被忽视的领域。方法:在将人类内皮祖细胞和脐带来源的间充质干细胞接种到脱细胞牛颈动脉上后,将管腔内皮细胞覆盖率(LECC)与细胞上清液中的葡萄糖和乳酸水平相关联。然后设计了一个闭合环路全血灌注系统。将LECC > 50%的再细胞化移植物和脱细胞血管移植物用人全血灌注2小时。每小时进行溶血和全血细胞计数评估,随后进行组织学和免疫组织化学分析。结果:虽然脱细胞移植物的全血灌注显著减少了血小板计数,但由再内皮化移植物结合导致的血小板消耗不显著(p = 0.7284)。此外,肉眼评估显示仅在未接种移植物的管腔中形成血栓,组织学特征显示再细胞化移植物中缺乏CD41阳性血小板,从而证实了它们的抗血栓性。结论:在本研究中,我们能够在体外全血灌注系统中证明血管移植物表面修饰对其抗血栓性的影响。据我们所知,这是第一项在接种后立即将工程化血管移植物暴露于以高流速再循环的人全血中的研究。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
用人血管细胞对脱细胞牛颈动脉进行表面修饰是否能降低其血栓形成性?
核心机制
再内皮化形成的内皮单层覆盖管腔表面,模拟生理性血管内壁,从而抑制血小板黏附和血栓形成。
主要证据
体外全血灌注实验:再细胞化移植物血小板消耗不显著(p = 0.7284),而脱细胞移植物显著降低血小板计数;宏观和组织学检查显示再细胞化移植物无血栓形成,且CD41染色阴性。
研究意义
该研究首次证明,在体外高流速全血灌注系统中,人血管细胞表面修饰的脱细胞异种移植物具有抗血栓性,为个性化生物血管移植物的临床应用提供了基础。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

脱细胞牛颈动脉的制备与验证

获得无细胞、保留细胞外基质的血管支架,并确认脱细胞效果和基质完整性。

牛颈动脉经物理和化学处理脱细胞,包括去离子水洗涤、酶消化、去垢剂和DNA酶处理;通过H&E染色确认无细胞核,免疫组化染色显示层粘连蛋白和胶原IV保留。

2

去细胞支架再细胞化

在脱细胞移植物管腔表面建立内皮细胞单层,以实现生理性覆盖。

将hECPC和hMSC共接种到dBCA上,采用动态接种和静态培养,随后进行动态培养以逐渐增加剪切应力。

3

动态培养和剪切应力模拟

模拟生理血流条件,促进细胞成熟和内皮化。

使用生物反应器进行动态培养,逐步增加流速;通过计算流体动力学模拟壁剪切应力。

4

体外全血灌注测试

评估再细胞化和脱细胞移植物的血栓形成性。

将再细胞化(LECC>50%)和脱细胞移植物置于闭合环路灌注系统中,用人全血灌注2小时,定期检测溶血和血细胞计数,并进行组织学分析。

5

评估葡萄糖和乳酸作为管腔覆盖率指标

验证非侵入性代谢指标能否预测内皮覆盖率。

动态培养期间每日测量葡萄糖和乳酸水平,与最终LECC进行相关性分析,并通过ROC曲线确定最佳阈值。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
胰蛋白酶Sigma-Aldrich--
Triton X-100Roth--
DNA酶IRoche Diagnostics--
杜氏改良Eagle培养基Biochrom GmbH--
内皮基础培养基-2PromoCell GmbH--
胎牛血清Biochrom GmbH--
青霉素/链霉素Biochrom GmbH--
明胶Sigma-Aldrich--
谷氨酰胺Biochrom GmbH--
肝素----
石蜡Sigma-Aldrich / Merck--
抗层粘连蛋白抗体Abcamab11575
抗I型胶原抗体Abcamab6308
抗IV型胶原抗体Abcamab6586
抗CD34抗体Abcamab110643
抗CD31抗体Bioss Antibodies Inc.bs-0195R
抗eNOS抗体Abcamab5589
抗血管性血友病因子抗体Abcamab6994
抗CD90抗体Abcamab52625
山羊抗兔IgG二抗(Alexa Fluor 594)Abcamab150080
Dako LSAB2系统-HRPAgilent TechnologiesK0675
封片剂Merck--
抗CD41抗体Abcamab63983
抗CD45抗体Leica Biosystems--
Corline肝素偶联物Corline Biomedical--
蔡司Axio Observer.Z1显微镜Carl Zeiss AG--
ABL 800血气分析仪Radiometer--
NanoDrop 2000 C紫外-可见分光光度计Thermo Fisher Scientific--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
脱细胞
脱细胞方法:0.05% Trypsin/0.02% EDTA、0.1% Triton X-100、DNAse-I处理循环次数和时间
阅读提示:Methods 中 Decellularization of bovine carotid arteries (dBCA)
细胞培养
hECPC和hMSC的来源、培养基组成、细胞代次(hECPC P3-P6,hMSC P3-P7)
阅读提示:Methods 中 Cell isolation, expansion and culture
再细胞化
细胞接种密度(hECPC和hMSC数量)、比例(2:1)、接种流速(40 ml/h)、每轮时间(3小时)和轮数(8轮)
阅读提示:Methods 中 Dynamic seeding and static culture of hECPC and hMSC
动态培养
动态培养时间(10天 vs 14天)、流速逐步增加(0.6-8 ml/min)、剪切应力范围(0.0033-0.033 dynes/cm²)
阅读提示:Results 中 Cell viability and proliferation during dynamic culture 和 Fig. 2
全血灌注
灌注时间(2小时)、流速(6 ml/min)、肝素浓度(5 U/ml)、血小板计数评估时间点(t0, t1, t2)
阅读提示:Methods 中 Ex vivo whole blood perfusion of vascular grafts 和 Fig. 6