检测1,25(OH)2D3对皮肤细胞系中IL-33和ST2 mRNA和蛋白表达的影响
评估维生素D活性形式对皮肤主要细胞类型中IL-33及其受体ST2表达的影响。
用100 nM 1,25(OH)2D3处理角质形成细胞（HPEKp）、黑色素细胞（HEMas）、成纤维细胞（HDF）和基底细胞癌细胞（A431）4、8、24小时，收集细胞进行RT-qPCR和Western blot/免疫荧光分析。
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维生素D对皮肤细胞中IL-33及其受体ST2表达的影响；对银屑病的潜在意义
The Effects of Vitamin D on the Expression of IL-33 and Its Receptor ST2 in Skin Cells; Potential Implication for Psoriasis.
实验完整度
高研究包含体外细胞实验（原代角质形成细胞、黑色素细胞、成纤维细胞和A431细胞系），并通过siRNA和CRISPR/Cas9进行VDR敲低/敲除验证，还包含患者皮肤样本的mRNA和蛋白检测，以及VDR结合位点的in silico预测和ChIP-seq验证。
主要模型
人表皮角质形成细胞祖细胞（HPEKp） 人表皮黑色素细胞（HEMas） 人真皮成纤维细胞（HDF） A431基底细胞癌细胞系 银屑病患者皮肤活检样本
重点核对
1,25(OH)2D3处理浓度100 nM，处理时间4、8、24小时 VDR敲低使用siRNA（s14777）转染HPEKp细胞和CRISPR/Cas9敲除A431细胞 患者样本：18例银屑病患者和13例健康对照组，皮损和边缘皮肤活检 基因表达检测使用qRT-PCR，蛋白水平检测使用Western blot和免疫荧光
摘要
白细胞介素33（IL-33）属于IL-1家族，由皮肤等器官的上皮细胞和内皮细胞组成性产生。它参与组织稳态、修复和免疫应答的维持，包括Th2淋巴细胞的活化。IL-33参与包括银屑病在内的几种炎症性疾病的发病机制已被提出，但尚未完全了解。本研究旨在探讨银屑病中IL-33及其受体ST2的表达，以及活性形式维生素D（1,25(OH)2D3）对皮肤细胞中它们表达的影响。我们通过qPCR和免疫染色技术检测了18名银屑病患者和健康志愿者中IL-33和ST2的mRNA和蛋白谱。在培养的角质形成细胞、黑色素细胞、成纤维细胞和基底细胞癌细胞中测试了1,25(OH)2D3及其受体（VDR）对IL-33和ST2表达的可能影响。结果表明，1,25(OH)2D3以时间依赖的方式有效刺激角质形成细胞中IL-33及其受体ST2 mRNA的表达，在黑色素细胞中作用较弱，但在成纤维细胞中无作用。此外，维生素D对IL-33和ST2表达的作用依赖于VDR。最后，我们证明IL-33的mRNA表达主要在银屑病皮损中升高，而非在其边缘。有趣的是，与边缘组织和健康皮肤相比，银屑病皮损中ST2 mRNA下调。我们的数据表明，维生素D可以调节IL-33信号传导，为理解维生素D在银屑病治疗中的作用机制开辟了新的视角。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 维生素D是否影响皮肤细胞中IL-33及其受体ST2的表达？在银屑病中IL-33和ST2的表达有何变化？
- 核心机制
- 1,25(OH)2D3通过其受体VDR促进IL-33和ST2的表达，该作用依赖于VDR，且存在VDR结合位点。
- 主要证据
- 体外细胞实验显示1,25(OH)2D3上调角质形成细胞中IL-33和ST2的mRNA和蛋白；VDR敲低或敲除后此效应减弱；患者样本显示银屑病皮损中IL-33 mRNA升高而ST2 mRNA降低。
- 研究意义
- 研究为理解维生素D在银屑病治疗中的作用机制提供了新视角，可能有助于优化银屑病的治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证VDR在介导1,25(OH)2D3作用中的必要性
确定1,25(OH)2D3对IL-33和ST2的诱导作用是否依赖于VDR。
在HPEKp细胞中通过siRNA转染敲低VDR，在A431细胞中通过CRISPR/Cas9敲除VDR，然后用1,25(OH)2D3处理，检测VDR、CYP24A1、IL-33和ST2的mRNA和蛋白水平。
预测IL-33和ST2基因启动子区域的VDR结合位点
从基因组水平寻找维生素D调控IL-33和ST2转录的直接证据。
使用CiiiDER程序和JASPAR矩阵预测IL-33和ST2基因起始密码子上游区域的VDR结合位点，并利用公开ChIP-seq数据进行验证。
分析银屑病患者皮肤中IL-33和ST2的表达
比较银屑病皮损、边缘皮肤和健康对照皮肤中IL-33和ST2的表达差异。
采集18例银屑病患者的皮损和边缘皮肤活检，以及13例健康对照皮肤样本，提取RNA进行qRT-PCR检测IL-33和ST2 mRNA水平，并通过免疫荧光染色检测蛋白水平和定位。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 表皮角质形成细胞培养基 (CnT-07) | CELLnTEC | -- |
| 黑色素细胞培养基 (CnT-40) | CELLnTEC | -- | |
| 杜氏改良Eagle培养基 (DMEM) | Sigma Aldrich | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素 | -- | -- | |
| 链霉素 | -- | -- | |
| TrypLE Express消化液 | Gibco | -- | |
| 药物处理 | 1,25-二羟基维生素D3 | IsoSciences | -- |
| RNA提取和qPCR | ExtractMe总RNA提取试剂盒 | BLIRT S.A. | -- |
| Total RNA Prep Plus试剂盒 | A&A Biotechnology | -- | |
| RevertAid第一链cDNA合成试剂盒 | Thermo Scientific | -- | |
| SensiFast SYBR No-ROX试剂盒 | BioLine | -- | |
| StepOnePlus实时荧光定量PCR仪 | Applied Biosystems | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Sigma Aldrich | -- |
| 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物 | -- | -- | |
| Bradford蛋白定量法 | -- | -- | |
| Mini-PROTEAN TGX免染胶 | Bio-Rad | -- | |
| Trans-Blot Turbo转印系统 | Bio-Rad | -- | |
| ECL Plus化学发光底物 | Perkin Elmer | NEL 103001EA | |
| 抗体 | 抗VDR抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-13133 |
| 抗Cyp24抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-365700 | |
| 抗IL-33抗体 | Bioss | bs-2208R | |
| 抗ST2抗体 | Sigma-Aldrich | PRS3363 | |
| Alexa Fluor 488标记二抗 | Thermo Fisher Scientific | A11008 | |
| 抗兔二抗 | Santa Cruz Biotechnology | sc-2537 | |
| 抗小鼠二抗 | Sigma-Aldrich | A9044 | |
| Western blot | 抗β-肌动蛋白抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47778 |
| siRNA转染 | Silencer Select验证siRNA ID s14777 | Ambion | -- |
| Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Invitrogen | -- | |
| 阴性siRNA | Ambion | 4390844 | |
| CRISPR/Cas9基因敲除 | CRISPR/Cas9系统 | Synthego Corporation | -- |
| 免疫荧光 | 8孔Lab-Tek II腔室玻片 | Nalge Nunc | -- |
| Triton X100去污剂 | -- | -- | |
| 牛血清白蛋白 | -- | -- | |
| DAPI染料 | -- | -- | |
| 荧光显微镜 | Nikon Eclipse E800 or Olympus cell Vivo IX 83 | -- | |
| 数据分析 | ImageJ软件 | National Institutes of Health | v. 1.51j8 |
| 统计分析 | GraphPad Prism统计软件 | GraphPad Software | v. 7.00 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养和处理 | 细胞系：HPEKp、HEMas、HDF、A431；培养基和添加剂；1,25(OH)2D3浓度100 nM；处理时间4、8、24小时。 阅读提示：Methods 4.1 Cell Cultures 和 4.2 Treatments |
| VDR敲低/敲除 | siRNA序列和转染条件（25 pmol, 4-6 h）；CRISPR/Cas9 guide RNA设计和电穿孔条件；处理后检测时间点（48 h和72 h）。 阅读提示：Methods 4.5 VDR Silencing 和 4.6 VDR Gene Knock-Out |
| 患者样本收集和RNA提取 | 患者纳入和排除标准；活检样本来源（皮损和边缘）；RNA提取方法；qRT-PCR条件和引物序列。 阅读提示：Methods 4.3 Patients and Controls 和 4.4 RNA Extraction and Real-Time PCR |
| 蛋白质检测 | Western blot：抗体（抗IL-33、抗ST2、抗VDR、抗Cyp24、抗β-actin）和稀释比例；蛋白上样量（40 μg）；转膜条件。免疫荧光：固定、通透、封闭、一抗和二抗浓度及孵育条件。 阅读提示：Methods 4.7 Immunofluorescence Staining 和 4.8 Immunoblotting |
| VDR结合位点预测 | 使用的软件和数据库版本（CiiiDER、JASPAR、Ensembl、ChIP-Atlas）；序列范围（ATG上游10kb和10-20kb）；矩阵匹配分数阈值。 阅读提示：Methods 4.9 Prediction of Transcription Factor Binding Sites |