构建Gm364敲除小鼠模型
研究Gm364在体内的功能。
利用CRISPR/Cas9技术删除Gm364外显子1中的55bp，产生移码突变，导致蛋白完全缺失。通过Western blot和免疫荧光验证敲除效果。
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Gm364通过MIB2/DLL3/Notch2协调AKT激活调控女性生育力
Gm364 coordinates MIB2/DLL3/Notch2 to regulate female fertility through AKT activation.
实验完整度
高包含Gm364敲除小鼠模型、卵母细胞体外培养、免疫共沉淀、体外磷酸化实验、RNA-seq和RRBS等多层级验证，并明确功能与机制验证。
主要模型
Gm364敲除小鼠 小鼠卵母细胞 Sf9昆虫细胞
重点核对
CRISPR/Cas9介导Gm364基因敲除（删除外显子1中55bp） Gm364敲除导致原始卵泡、次级卵泡和有腔卵泡数量减少 γ-分泌酶抑制剂RO4929097（4 nM）处理卵母细胞24小时 AKT抑制剂Perifosine（3 μM）处理卵母细胞16小时 体外受精及胚胎培养至囊胚阶段的发育率
摘要
许多整合膜蛋白可能作为特定功能微域中不可或缺的协调者，以维持已知受体（如Notch）的正常运作。Gm364是一种多次跨膜蛋白，已被筛选为潜在的女性生育力因子。然而，至今尚无关于其在女性生育力中功能的报道。在此，我们发现Gm364的全身性敲除减少了原始卵泡和生长卵泡的数量，通过增加的ROS和γ-H2AX、降低的线粒体膜电位、降低的卵母细胞成熟率以及增加的非整倍体表明卵母细胞质量受损。机制上，Gm364直接结合并将泛素连接酶MIB2锚定在膜上。随后，膜上的MIB2泛素化并激活DLL3。接着，激活的DLL3结合并激活Notch2，Notch2随后在细胞质内被切割产生NICD2，即Notch2的细胞内活性结构域。最后，NICD2可以直接激活细胞质内的AKT，以调节卵母细胞减数分裂和质量。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Gm364是否以及如何调节女性生育力和卵母细胞质量？
- 核心机制
- Gm364结合并锚定MIB2于膜上，MIB2泛素化激活DLL3，激活的DLL3激活Notch2，产生NICD2，NICD2直接在细胞质内磷酸化AKT（S473和T308），从而调节卵母细胞减数分裂和质量。
- 主要证据
- Gm364敲除小鼠显示卵泡数量减少、卵母细胞质量下降（ROS升高、线粒体膜电位降低、非整倍体增加）、NICD2和p-AKT水平降低；体外磷酸化实验表明NICD2直接磷酸化AKT；siRNA敲低Gm364和AKT抑制均降低卵母细胞成熟率。
- 研究意义
- 该研究首次证明整合膜蛋白Gm364通过协调Notch2信号和AKT激活来调节女性生育力，为理解膜蛋白在减数分裂中的作用提供了新见解，可能有助于揭示女性生殖障碍的机制。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估Gm364敲除对卵泡和卵母细胞质量的影响
确定Gm364缺失是否影响卵泡发育和卵母细胞质量。
通过卵泡计数、γ-H2AX免疫荧光、卵母细胞成熟率、ATP水平、线粒体膜电位、ROS水平、非整倍体分析等评估。
鉴定Gm364相互作用蛋白
寻找Gm364的潜在结合伙伴，揭示其分子机制。
使用Gm364抗体进行免疫共沉淀，SDS-PAGE和银染，差异条带进行MALDI质谱鉴定。验证与MIB2、DLL3、Notch2的相互作用。
分析Gm364对MIB2定位和DLL3泛素化的影响
确定Gm364是否通过影响MIB2和DLL3来调节Notch2信号。
通过免疫荧光检测MIB2定位，免疫共沉淀验证相互作用，DLL3泛素化水平检测，免疫电镜观察蛋白质距离。
验证NICD2对AKT的调控
明确NICD2是否直接激活AKT。
通过四种模型排除其他途径，检测p-AKT水平，体外磷酸化实验验证NICD2直接磷酸化AKT。
评估Gm364敲除对胚胎发育的影响
确定Gm364缺失是否影响胚胎着床和发育。
分析不同天数（DPC 5, 10, 14, 18）胚胎形态、数量和NICD2/p-AKT水平，体外培养受精卵至囊胚。
转录组和DNA甲基化分析
确定Gm364敲除对基因表达和表观遗传的影响。
对Gm364-KO和WT卵巢进行RNA-seq和RRBS，分析差异表达基因和差异甲基化区域。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
基因编辑与动物模型
卵母细胞体外培养与处理
分子相互作用分析
蛋白表达与体外验证
组学分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 基因敲除小鼠构建 | MEGAshortscript™试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| MEGAclear™试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| mMessage mMachine T7试剂盒 | Thermo Fisher | -- | |
| poly A加尾试剂盒 | Thermo Fisher | -- | |
| RNeasy Micro试剂盒 | Qiagen | -- | |
| 卵母细胞培养 | MEM+培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | Thermo Fisher | -- | |
| γ-secretase抑制 | RO4929097 | Selleck | 847925-91-1 |
| AKT抑制 | Perifosine | Selleck | 157716-52-4 |
| 体外受精 | MEM+培养基 | -- | -- |
| 胚胎培养 | KSOM培养基 | Millipore | MR-020P-5F |
| 卵母细胞免疫荧光 | Triton X-100 | -- | -- |
| PHEM缓冲液 | -- | -- | |
| 脂筏提取 | UltraRIPA脂筏提取试剂盒 | BioDynamics Laboratory Inc. | -- |
| 胚胎染色 | 台盼蓝 | Solarbio Life Sciences | 72-57-1 |
| 免疫沉淀 | 蛋白A/G磁珠 | Yeasen | -- |
| 蛋白酶抑制剂 | Sigma | -- | |
| 磷酸酶抑制剂 | Sigma | -- | |
| 蛋白表达与纯化 | pFastBacHTA载体 | Thermo Fisher | -- |
| DH10Bac大肠杆菌 | Vazyme | -- | |
| QIAfilter质粒纯化试剂盒 | Qiagen | -- | |
| Cellfectin® II转染试剂 | Thermo Fisher | -- | |
| SFM900-II培养基 | Thermo Fisher | -- | |
| Ni-NTA Superflow树脂 | Qiagen | -- | |
| 高压细胞破碎仪 | Union Biotech | -- | |
| 层析柱 | Biocomma Co. | -- | |
| 原核蛋白表达 | pRSETB载体 | -- | -- |
| BL21-DE感受态大肠杆菌 | Vazyme | -- | |
| 线粒体膜电位检测 | JC-1染料 | Yeasen | 40706ES60 |
| ROS检测 | ROS检测试剂盒 | Beyotime | S0033 |
| 免疫电镜 | 驴抗兔IgG/15 nm金颗粒 | -- | -- |
| 驴抗兔IgG/35 nm金颗粒 | -- | -- | |
| 驴抗兔IgG/10 nm金颗粒 | -- | -- | |
| 透射电镜 | 透射电子显微镜（FEI Tecnai G2 Spirit Bio Twin） | Thermo Fisher Scientific | -- |
| siRNA合成 | T7 Ribomax Express RNAi系统 | Promega | -- |
| siRNA转染 | N-TER纳米颗粒siRNA转染系统 | Millipore, Sigma | -- |
| DNA提取 | QIAamp DNA Blood Maxi试剂盒 | Qiagen | -- |
| RRBS | EZ DNA甲基化Gold试剂盒 | ZYMO Research | -- |
| RNA测序 | BGISEQ-500测序平台 | Beijing Genomics Institute | -- |
| RRBS | Illumina HiSeq 3000测序平台 | Illumina | -- |
| Western blot | 抗GAPDH抗体 | YEASEN | 30201ES60 |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Sigma | A5316-100 | |
| 抗β-微管蛋白抗体 | Santa Cruz | sc-5274 | |
| 抗α-微管蛋白（乙酰化Lys40）抗体 | Bioss | bsm-33235M | |
| 染色体铺片 | 人抗着丝粒CREST抗体 | Antibodies Incorporated | 15-234 |
| Western blot | 抗Notch2抗体 | Abcam | ab8926 |
| 抗切割Notch2（Asp 1733）抗体 | Affinity biosciences | AF5255 | |
| 抗DLL3抗体 | Abcam | Ab103102 | |
| 抗MIB2抗体 | ABclonal | A17829 | |
| 抗RICTOR磷酸化（Thr1135）抗体 | Cell Signaling Technology | D30A3 | |
| 抗AKT抗体 | BBI Life science | D151616-0100 | |
| 抗磷酸化AKT（Thr308）抗体 | Cell Signaling Technology | 13038 | |
| 抗磷酸化AKT（Ser473）抗体 | Cell Signaling Technology | 4060 | |
| 抗strep II标签抗体 | Yifeixue | YFMA0054 | |
| 抗flag标签抗体 | BBI Life science | D190828 | |
| 抗Gm364抗体 | Yingji BioTech | -- | |
| HRP标记的兔抗山羊IgG | Vazyme | -- | |
| HRP标记的山羊抗小鼠IgG | Vazyme | -- | |
| 免疫荧光 | Cy2标记的驴抗兔IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 711-225-152 |
| Cy2标记的驴抗小鼠IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratory | I715-225-150 | |
| 罗丹明（TRITC）标记的驴抗兔IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 711-025-152 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 基因敲除小鼠构建 | Gm364基因敲除是否确实删除外显子1中55bp并导致移码；sgRNA序列和cas9 mRNA注射方法；小鼠品系（C57/B6） 阅读提示：Materials and methods: Animal models |
| 卵母细胞培养和药物处理 | 培养基MEM+成分和FBS浓度；RO4929097（4 nM）处理24小时；Perifosine（3 μM）处理16小时；培养条件（37°C，5% O2，5% CO2） 阅读提示：Materials and methods: Oocyte collection and in vitro culture |
| 卵泡计数 | 小鼠月龄（2月龄）；PMSG注射剂量和时机；切片厚度（5 μm）和计数方法（每隔两张切片） 阅读提示：Materials and methods: Ovarian hematoxylin-eosin staining and ovary follicle counting |
| 免疫沉淀和相互作用验证 | 抗体特异性（Gm364、Notch2、NICD2、MIB2、DLL3、AKT、RICTOR）；IP缓冲液成分；卵母细胞数量（400个） 阅读提示：Materials and methods: Immunoprecipitation |
| 体外磷酸化实验 | 重组蛋白表达和纯化方法（Bac-to-bac系统，Ni-NTA树脂）；反应条件（等摩尔混合，1 mM ATP，RT 20 min） 阅读提示：Materials and methods: Expression and purification of recombinant NICD2 and AKT proteins, In vitro phosphorylation assays |
| RNA-seq和RRBS | 卵巢取样时间（PND21）；差异表达/甲基化阈值（|log2|>2，q<0.001） 阅读提示：Materials and methods: RNA sequencing and analysis, Reduced representation bisulfite sequencing |