验证ESRRB在piPSCs中的表达和功能
确定ESRRB过表达对piPSCs自我更新和分化潜能的影响
构建ESRRB过表达的piPSCs，通过qRT-PCR、Western blot和免疫荧光验证过表达效率，观察细胞形态、AP染色、EB形成和三胚层分化标志物表达，并进行EdU和凋亡分析。
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ESRRB通过直接调控CDX2促进诱导多能干细胞向滋养层样干细胞的转化
ESRRB Facilitates the Conversion of Trophoblast-Like Stem Cells From Induced Pluripotent Stem Cells by Directly Regulating CDX2.
实验完整度
高包含体外细胞实验、嵌合胚胎实验、RNA-seq、ChIP-seq、IP-MS、启动子荧光素酶报告实验及突变分析等多层级验证。
主要模型
猪诱导多能干细胞（piPSCs） 猪孤雌胚胎（嵌合受体） HEK293T细胞（用于报告基因实验）
重点核对
ESRRB过表达构建和验证（qRT-PCR、Western blot） 嵌合实验中ESRRB-piPSCs向TE嵌合的比例 CDX2启动子荧光素酶报告实验 shRNA敲低ESRRB后TSC标记物表达变化 ESRRB截短体（N端/ C端）对CDX2调控的影响
摘要
猪诱导多能干细胞（piPSCs）可作为人类干细胞临床前研究的优良模型系统。然而，piPSCs的多能性基因网络，尤其是核心转录因子雌激素相关受体β（ESRRB）的功能，尚不清楚。在此，我们构建了过表达ESRRB的piPSCs（ESRRB-piPSCs）。与对照piPSCs（CON-piPSCs）相比，ESRRB-piPSCs表现出扁平、单层集落形态。此外，ESRRB-piPSCs相比CON-piPSCs显示出更强的向滋养外胚层的嵌合能力。我们发现ESRRB可通过结合滋养层干细胞（TSC）特异性标记物（包括KRT8、KRT18和CDX2）的启动子区域直接调控其表达。突变分析证明，ESRRB的N端锌指结构域对其调控TSC标记物是不可或缺的。此外，这种调控需要OCT4的参与。因此，ESRRB与OCT4的协同作用促进了从多能状态向滋养层样状态的转化。我们的结果证明了ESRRB在决定piPSCs命运中的独特和关键作用，并为胚胎和胚外谱系分离的分子机制提供了新的见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- ESRRB在猪诱导多能干细胞（piPSCs）多能性维持和分化中的功能是什么？
- 核心机制
- ESRRB通过其N端锌指结构域直接结合并激活CDX2、KRT8等滋养层干细胞标记基因的启动子，且此过程需要OCT4的参与，两者协同促进多能状态向滋养层样状态的转化。
- 主要证据
- ESRRB过表达导致piPSCs向滋养外胚层嵌合能力增强，RNA-seq和ChIP-seq显示ESRRB直接靶向CDX2等基因，启动子荧光素酶报告实验证实ESRRB直接激活CDX2启动子，IP-MS和BiFC证实ESRRB与OCT4及KRT8的相互作用。
- 研究意义
- 该研究揭示了ESRRB在决定piPSCs命运中的独特作用，为理解胚胎和胚外谱系分离的分子机制提供了新见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估ESRRB过表达对体内嵌合能力的影响
检测ESRRB过表达是否增强piPSCs向滋养外胚层分化的能力
将PKH26标记的ESRRB-和CON-piPSCs注射到八细胞期猪孤雌胚胎中，培养至囊胚，通过免疫荧光检测CDX2和PKH26共定位，统计嵌合率。
鉴定ESRRB的直接靶基因
验证CDX2是否是ESRRB的直接靶基因
通过qRT-PCR检测ESRRB过表达后TSC标记物的表达，通过启动子荧光素酶报告实验检测ESRRB对CDX2启动子的激活，以及通过shRNA敲低ESRRB观察CDX2表达的变化。
确定ESRRB调控CDX2的功能域
确定ESRRB的哪一结构域对调控CDX2至关重要
构建全长、N端（缺乏配体结合域）和C端（缺乏锌指结构域）的ESRRB表达载体，在piPSCs中过表达，检测细胞形态、AP染色、TSC标记物表达和CDX2启动子活性。
研究OCT4与ESRRB的协同作用
探究OCT4是否参与ESRRB对CDX2的调控
在piPSCs中插入OCT4-ESRRB（OE）、OCT4-SOX2（OS）、ESRRB-SOX2（ES）和GFP组合，观察DOX撤除后的细胞状态和CDX2表达，并通过IP-MS和BiFC分析蛋白相互作用。
通过ChIP-seq分析ESRRB的全基因组结合
鉴定ESRRB在全基因组上的结合位点和直接靶基因
使用FLAG抗体对FLAG-ESRRB-piPSCs进行ChIP-seq，分析结合位点分布、富集的GO和KEGG通路、识别结合的DNA基序，并整合RNA-seq和ChIP-seq数据确定直接靶基因。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Hyclone | -- |
| 胎牛血清 | VISTECH | VIS59216269 | |
| 非必需氨基酸 | Gibco | -- | |
| L-谷氨酰胺补充剂 | Gibco | -- | |
| β-巯基乙醇 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 白血病抑制因子 | Sino Biological | -- | |
| 碱性成纤维细胞生长因子 | Sino Biological | -- | |
| CHIR99021 | MCE | -- | |
| SB431542 | Selleck | -- | |
| 多西环素 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 细胞消化 | TrypLE Select消化液 | Invitrogen | -- |
| 质粒构建 | NovoRec一步PCR克隆试剂盒 | Novoprotein | -- |
| 病毒包装 | 聚乙烯亚胺 | PolyScience | -- |
| 聚凝胺 | -- | -- | |
| RNA提取 | RNAiso Plus试剂 | TaKaRa | -- |
| 反转录 | PrimeScript反转录试剂盒 | Tiangen | -- |
| qRT-PCR | SYBR Premix Ex Taq II | Tiangen | -- |
| 碱性磷酸酶染色 | 快红TR | Sigma-Aldrich | -- |
| 萘酚AS-MX | Sigma-Aldrich | -- | |
| Hoechst33342染料 | Beyotime | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | -- |
| SDS-PAGE上样缓冲液 | Beyotime | -- | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| Trans-Blot SD转印系统 | Bio-Rad | -- | |
| ECL化学发光试剂 | Tanon | -- | |
| 化学发光成像系统 | Tanon | -- | |
| EdU染色 | Cell-Light EdU Apollo643体外试剂盒 | RIB BIO | -- |
| 凋亡分析 | Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒 | Vazyme | -- |
| 胚胎操作 | M2培养基 | -- | -- |
| PZM3培养基 | -- | -- | |
| 荧光素酶实验 | 双荧光素酶检测试剂盒 | Beyotime | RG027 |
| pRL-TK内参质粒 | -- | -- | |
| RNA-seq | TRIZOL试剂 | TaKaRa | -- |
| ChIP-seq | 抗FLAG抗体 | -- | -- |
| 免疫沉淀-质谱 | 抗FLAG磁珠 | -- | -- |
| 微球菌核酸酶 | -- | -- | |
| 抗体 | OCT4抗体 | Santa Cruz | sc-5279 |
| SOX2抗体 | Proteintech | 66411-1-Ig | |
| ESRRB抗体 | Proteintech | 22644-1-Ig | |
| AFP抗体 | Proteintech | 14550-1-AP | |
| 结蛋白抗体 | Proteintech | 16520-1-AP | |
| TUBB3抗体 | Proteintech | 66375-1-Ig | |
| CDX2抗体 | Bioss | bs-6694R | |
| KRT8抗体 | Proteintech | 14550-1-AP | |
| 肌动蛋白抗体 | Proteintech | 66411-1-Ig | |
| 荧光素酶载体 | PGL3-basic载体 | Promega | E1751 |
| 质粒构建 | 慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-puromycin | SBI | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | piPSCs培养条件：LBCS培养基成分、饲养层细胞、传代比例和传代时间。 阅读提示：参见Material and Methods中的Cell Culture。 |
| ESRRB过表达 | ESRRB过表达构建方法：慢病毒载体、感染条件（polybrene处理时间）、筛选浓度（puromycin 10 μg/ml）和处理时间（12 h）。 阅读提示：参见Material and Methods中的Vector Construction和Lentivirus Packaging and Transduction。 |
| 嵌合实验 | 细胞注射数量（5-10个）、胚胎发育时期（八细胞期）、培养时间（72小时）、嵌合率统计方式。 阅读提示：参见Material and Methods中的Microinjection of piPSCs Into Eight-Cell Embryos和Results第2部分。 |
| 启动子荧光素酶报告实验 | 质粒用量：ESRRB/domain质粒0.5 μg、启动子报告质粒0.5 μg、pRL-TK 0.01 μg；转染时间12小时；检测时间48小时。 阅读提示：参见Material and Methods中的Luciferase Assay和Results第3、4部分。 |
| shRNA敲低 | shRNA序列、敲低效率（>60%）、筛选药物（puromycin）及筛选时间。 阅读提示：参见Material and Methods中的shRNA Vector Construction和Results第3部分。 |