SLC34A2上调和SLC4A4下调与甲状腺乳头状癌的侵袭、转移及MAPK信号通路相关

SLC34A2 Up-regulation And SLC4A4 Down-regulation Correlates With Invasion, Metastasis, And The MAPK Signaling Pathway In Papillary Thyroid Carcinomas.

作者信息Fengyan Huang, Haitao Wang, Juan Xiao, Chunchun Shao, Yong Zhou, Wei Cong, Maosong Gong, Jingfu Sun, Liqun Shan, Zhanyu Hao, Lihua Wang, Shouluan Ding, Zhigang Yu, Jianing Liu, Hongying Jia

PMID34405007

期刊J Cancer

发布时间2021-07-13

DOI10.7150/jca.56730

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实验完整度

中

基于临床样本进行多种分子实验（RT-PCR、Western blot、IHC）验证表达，并利用公共数据库进行生物信息学分析，但缺乏功能获得/丧失实验及动物模型验证。

主要模型

甲状腺乳头状癌患者肿瘤组织相邻正常甲状腺组织 GEO和TCGA数据库队列

重点核对

样本来源：48例PTC患者肿瘤及相邻正常甲状腺组织蛋白表达判定：Western blotting，以肿瘤/正常比值>1.0为高表达，<1.0为低表达尿碘浓度分组：<100 μg/L（碘缺乏），100-299 μg/L（碘适宜），≥300 μg/L（碘过量） MAPK蛋白检测：p-ERK、p-JNK、p-P38等抗体及稀释度

摘要

甲状腺乳头状癌（PTC）是过去十年中检测到的最快速增长的内分泌系统恶性肿瘤之一。不幸的是，超过25%的PTC患者具有侵袭性和随后的转移特征；这些特征通常提示预后不良。最近，越来越多的证据表明溶质载体（SLC）转运蛋白可能在人类癌症的发生、侵袭和转移中发挥关键作用。然而，SLC转运蛋白在PTC患者中的表达及临床病理学意义仍未确定。在本研究中，我们旨在阐明SLC转运蛋白的差异表达如何影响临床病理学特征，并确定可能涉及的调控信号通路。通过生物信息学方法，从基因表达综合数据库（GEO）和癌症基因组图谱（TCGA）数据库中筛选出三个差异表达的SLC转运蛋白。结果表明，高SLC34A2和低SLC4A4蛋白表达的患者表现出更高比例的包膜侵犯和甲状腺外转移。Logistic回归分析显示，肿瘤中高SLC34A2表达被确定为包膜侵犯[比值比(OR)=11.400，95%置信区间(CI)=1.733-74.995，P=0.011]和甲状腺外转移(OR=4.920，95%CI=1.234-19.623，P=0.024)的独立危险因素，而肿瘤中低SLC4A4表达仅被确定为甲状腺外转移的独立危险因素(OR=8.568，95%CI=1.186-61.906，P=0.033)。具体而言，对于有包膜侵犯和甲状腺外转移的肿瘤，SLC34A2蛋白表达染色在滤泡上皮细胞的细胞质中显著增强，相反，SLC4A4表达在细胞膜和细胞核中显著减弱。有趣的是，高SLC34A2和低SLC4A4蛋白表达均与PTC患者的高尿碘浓度显著相关。在机制上，与相邻的正常甲状腺相比，p-ERK在侵袭性肿瘤中显著上调17.8%；对于转移性肿瘤，p-ERK、p-JNK和p-P38分别显著上调29.2%、67.1%和38.9%。重要的是，SLC4A4与p-JNK（r=-0.696，P=0.004）和p-P38（r=-0.534，P=0.049）呈负相关。总之，我们提出上调的SLC34A2（主要在细胞质中）和下调的SLC4A4（主要在细胞膜和细胞核中）可能与PTC的甲状腺外转移密切相关，这或许可归因于过量碘摄入。此外，SLC4A4的这种作用可能通过激活JNK/P38 MAPK信号通路实现。未来需要体内和体外的功能获得或丧失实验来验证这些发现，并进一步阐明更深入的分子机制。

生物信息学筛选差异表达SLC转运蛋白

利用公共数据库筛选与PTC相关的差异表达SLC转运蛋白。

通过GEO四个数据集（GSE3678, GSE29265, GSE50901, GSE33630）筛选差异表达基因，与TCGA数据结合进行表达和生存分析，最终选择SLC34A2、SLC4A4和SLC25A15进行后续验证。

验证候选基因表达

验证生物信息学筛选结果在临床样本中的准确性。

使用RT-PCR和Western blotting检测8对配对样本中SLC34A2、SLC4A4和SLC25A15的mRNA和蛋白表达。

临床病理特征关联分析

评估SLC34A2和SLC4A4蛋白表达与PTC患者临床病理特征的关系。

对48例PTC患者的肿瘤组织进行Western blotting检测，并分析蛋白表达与包膜侵犯、甲状腺外转移、淋巴结转移、尿碘浓度等特征的相关性。

蛋白定位分析

确定SLC34A2和SLC4A4蛋白在PTC组织中的亚细胞定位。

使用免疫组织化学染色观察SLC34A2和SLC4A4在有包膜侵犯和甲状腺外转移的PTC组织中的表达定位。

MAPK通路激活分析

评估MAPK信号通路（ERK、JNK、P38）的磷酸化状态与PTC侵袭和转移的关系。

通过Western blotting检测p-ERK、p-JNK、p-P38在侵袭性和转移性肿瘤中的表达，并与相邻正常组织比较。

实验环节	名称	品牌	货号
RNA提取和RT-PCR	RNA提取试剂盒	Servicebio	G3013
RT-PCR	反转录合成试剂盒	Servicebio	G3330
RT-PCR	LightCycler 480 系统	Roche Diagnostics	--
Western blotting	SLC34A2一抗	CST	D6W2G
	SLC4A4一抗	Abcam	ab187511
	SLC25A5一抗	Abcam	ab228604
	ERK一抗	Bioss	bsm-33337M
	p-ERK一抗	Bioss	bs-1522R
	JNK一抗	Elabscience	E-AB-60070
	p-JNK一抗	Boster	BM4380
	P38一抗	Elabscience	E-AB-32459
	p-P38一抗	Elabscience	E-AB-21027
	β-actin一抗	Zhongshan Golden Bridge	17AV0412
	辣根过氧化物酶标记二抗	Zhongshan Golden Bridge	ZB-2301
	化学发光试剂	Millipore	WBKLSO100
	AlphaView SA软件	--	--

环节	核对要点
样本收集与伦理	样本来源：山东大学第二医院甲状腺外科，2019年7月至12月，48例PTC患者；纳入标准包括初治、未接受术前治疗、无肝肾功能障碍等阅读提示：Materials and Methods, Study population selected
RT-PCR	使用RNA试剂盒提取总RNA，反转录试剂盒合成cDNA，RT-PCR在LightCycler 480系统进行，引物序列已提供，GAPDH为内参，2^-ΔΔCt法计算相对表达阅读提示：Materials and Methods, Tissue RNA isolation and real-time PCR
Western blotting	蛋白提取使用含磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液，BCA法测定浓度，SDS-PAGE电泳，PVDF膜转膜，5%脱脂牛奶封闭，一抗稀释度如SLC34A2（1:1000）等阅读提示：Materials and Methods, Tissue protein extraction and western blotting
免疫组化	组织固定于4%多聚甲醛，石蜡包埋，脱蜡水化，3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶，一抗稀释度1:10000，DAB显色，苏木素复染阅读提示：Materials and Methods, Immunohistochemical staining
尿碘浓度评估	UIC检测方法参考文献，按WHO标准分组：<100 μg/L（缺乏），100-299 μg/L（适宜），≥300 μg/L（过量）阅读提示：Materials and Methods, Iodine nutrition status evaluation

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