建立脑梗死小鼠模型
通过永久性大脑中动脉闭塞建立运动、认知和情绪缺陷的脑梗死模型。
对CB-17小鼠进行电凝切断大脑中动脉主干，诱导永久性局灶性脑梗死；对照组进行假手术。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
小鼠脑梗死亚急性期静脉注射人羊膜间充质干细胞通过免疫调节抑制血脑屏障破坏和细胞凋亡改善神经功能障碍
Intravenous Administration of Human Amniotic Mesenchymal Stem Cells in the Subacute Phase of Cerebral Infarction in a Mouse Model Ameliorates Neurological Disturbance by Suppressing Blood Brain Barrier Disruption and Apoptosis via Immunomodulation.
实验完整度
高包含行为学、分子表达（RT-qPCR、Western blot）、免疫组化、明胶酶谱、伊文思蓝、TUNEL等多层级验证，包含体外细胞与体内动物模型。
主要模型
CB-17小鼠永久性大脑中动脉闭塞模型 人羊膜间充质干细胞
重点核对
hAMSCs的剂量：4×10^6细胞/kg（高剂量）和2×10^6细胞/kg（低剂量） 给药时间：MCAO后24小时经颈静脉注射 行为学评估时间：MCAO后1至2个月 分子检测时间点：MCAO后7天 BBB通透性评估：MCAO后48小时伊文思蓝注射
摘要
神经炎症在脑梗死的病理生理中起关键作用。细胞疗法因其免疫调节作用而提供了一种新的治疗选择。羊膜干细胞因其低免疫原性、低致瘤性以及易于从分娩后丢弃的羊膜中获得而显示出前景。我们已成功分离和扩增了人羊膜间充质干细胞（hAMSCs）。在此，我们评估了hAMSCs对脑梗死后神经功能缺损的治疗效果及其在小鼠模型中的免疫调节作用，以了解其作用机制。在永久性大脑中动脉闭塞（MCAO）一天后，静脉注射hAMSCs。在MCAO后8天进行TNFα、iNOS、MMP2和MMP9的RT-qPCR，iNOS和CD11b/c的免疫荧光染色，以及TUNEL检测。在MCAO后2天和数月分别进行伊文思蓝实验和行为学测试。结果表明，通过给予hAMSCs，脑梗死引起的神经功能缺损以剂量依赖性方式得到改善。其机制似乎是通过抑制促炎细胞因子和M2向M1表型转换，减少血脑屏障的破坏和梗死周围区域的细胞凋亡。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 在脑梗死亚急性期静脉注射人羊膜间充质干细胞（hAMSCs）是否能改善神经功能缺损，其机制是否涉及免疫调节？
- 核心机制
- hAMSCs通过抑制促炎细胞因子（TNFα、iNOS、MMP2、MMP9）的表达和M2向M1表型转换，减少血脑屏障破坏和梗死周围区域细胞凋亡。
- 主要证据
- 在永久性MCAO小鼠模型中，hAMSCs治疗（高剂量）改善了多种行为学测试结果，降低了iNOS阳性细胞、TUNEL阳性细胞数量，抑制了MMP9活性，并减少了伊文思蓝外渗。
- 研究意义
- 该研究首次证明羊膜来源间充质干细胞的作用具有剂量依赖性，可能为常规再灌注治疗失败后的急性期提供一种新的治疗选择。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
hAMSCs给药
评估亚急性期静脉注射hAMSCs对脑梗死后神经功能的影响。
MCAO后24小时，经颈静脉注射高剂量（4×10^6细胞/kg）或低剂量（2×10^6细胞/kg）hAMSCs，或仅注射乳酸林格氏液（载体对照）。
行为学评估
评估MCAO后小鼠的神经行为缺陷及hAMSCs的改善作用。
MCAO后1-2个月进行旷场实验、悬挂实验、Y迷宫、水迷宫、被动回避和开放空间游泳测试。
炎症因子表达检测
检测hAMSCs对促炎细胞因子表达的影响。
MCAO后7天，通过RT-qPCR检测TNFα、iNOS、MMP2、MMP9的mRNA表达；通过Western blot检测TNFα和caspase3；通过明胶酶谱法检测MMP活性。
免疫细胞浸润分析
分析hAMSCs对梗死周围区域促炎性免疫细胞的影响。
MCAO后7天，通过免疫组化检测iNOS和CD11b/c阳性细胞的分布，并通过抗stem101抗体检测移植的hAMSCs。
血脑屏障通透性检测
评估hAMSCs对脑梗死后的血脑屏障保护作用。
MCAO后48小时，通过颈静脉注射伊文思蓝，检测其在脑组织中的外渗量。
凋亡检测
评估hAMSCs对梗死周围区域延迟性神经元凋亡的影响。
MCAO后7天，通过TUNEL染色和Western blot检测caspase3活性片段评估细胞凋亡。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | NeoSERA | -- | -- |
| RT-qPCR | RNAlater RNA稳定试剂 | Qiagen | -- |
| RNeasy小型试剂盒 | Qiagen | -- | |
| ReverTra Ace qPCR RT预混液 | Toyobo | -- | |
| THUNDERBIRD SYBR qPCR预混液 | Toyobo | -- | |
| 免疫组化 | Blocking One Histo封闭液 | Nacalai Tesque | -- |
| 抗stem101抗体 | Takara | Y-40400 | |
| 免疫荧光 | 抗iNOS抗体 | Funakoshi | MAB9502 |
| 抗CD11b/c抗体 | Bioss | bs-1014R | |
| Alexa Fluor 488或555偶联二抗 | Cell Signaling Technologies | -- | |
| DAPI | Sera Care | -- | |
| 免疫组化 | BZ-X荧光显微镜 | Keyence Corporation | -- |
| Western blot | EzRIPA裂解试剂盒 | Atto Corporation | -- |
| BCA蛋白测定 | Thermo Scientific | -- | |
| PVDF膜 | Atto Corporation | -- | |
| EzBlock Chemi封闭液 | Atto Corporation | -- | |
| EzWestLumi plus发光液 | Atto Corporation | -- | |
| 抗TNFα抗体 | Santa Cruz | sc-52746 | |
| 抗caspase3抗体 | Santa Cruz | sc-7272 | |
| 明胶酶谱法 | 明胶酶谱试剂盒 | Cosmo Bio Corporation | -- |
| Evans Blue | 伊文思蓝染料 | -- | -- |
| TUNEL | 原位细胞死亡检测试剂盒（POD） | Sigma-Aldrich | -- |
| 行为学 | JMP ver. 13 | SAS Institute Inc. | -- |
| Western blot | LuminoGraph 1成像系统 | Atto Corporation | -- |
| 明胶酶谱法 | ES-8500扫描仪 | Epson | -- |
| Evans Blue | SPECTRA max PLUS384 | Molecular Devices | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| MCAO模型 | 小鼠品系：CB-17/Icr-+/+Jcl；周龄/性别：7-9周龄雄性；手术方法：电凝切断大脑中动脉主干；麻醉：2%异氟烷。 阅读提示：Materials and Methods: Animals, Induction of Permanent Focal Cerebral Infarction |
| hAMSCs给药 | 细胞来源：人羊膜间充质干细胞；制备方法：胶原酶/分散酶处理，NeoSERA培养基扩增；给药剂量：高剂量4×10^6细胞/kg，低剂量2×10^6细胞/kg；给药途径：颈静脉注射；给药时间：MCAO后24小时。 阅读提示：Materials and Methods: Cell Preparation and Administration of hAMSCs |
| 行为学评估 | 测试时间：MCAO后1-2个月；测试项目：旷场、悬挂、Y迷宫、水迷宫、被动回避、开放空间游泳；实验者盲法。 阅读提示：Materials and Methods: Behavioral Tasks |
| 分子表达检测 | 检测组织：MCAO后7天脑组织（同侧半球）；检测指标：TNFα、iNOS、MMP2、MMP9的mRNA表达；检测方法：RT-qPCR（△△CT法，内参GAPDH）；Western blot检测TNFα和caspase3。 阅读提示：Materials and Methods: Quantitative Real-Time RT–PCR, Western Blotting |
| 免疫组化/免疫荧光 | 检测时间：MCAO后7天；组织切片厚度：10µm；检测靶标：iNOS、CD11b/c、stem101；计数区域：梗死周围区，每张切片3个随机视野，每脑2张切片；样本量：每组n=3。 阅读提示：Materials and Methods: Immunohistochemistry |
| 血脑屏障通透性 | 检测时间：MCAO后48小时，hAMSC给药后24小时；EB染料浓度和体积：4% PBS，4mL/kg；孵育时间和温度：55℃、2天；检测波长：620nm。 阅读提示：Materials and Methods: Evans Blue Assay |
| 细胞凋亡检测 | 检测时间：MCAO后7天；TUNEL染色步骤：固定、冷冻切片、透化、TdT标记；计数区域：梗死周围区，每张切片3个随机视野，每脑2张切片；样本量：每组n=3。 阅读提示：Materials and Methods: Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (TdT)-Mediated dUTP Nick End Labelling (TUNEL) Assay |