建立mEERL-hEGFR细胞系
生成表达hEGFR的鼠源口腔癌细胞系，用于模拟临床hEGFR靶向NIR-PIT的模型。
通过逆转录病毒转导将hEGFR转入mEERL细胞，经zeocin筛选和单克隆化，选择hEGFR表达克隆。通过RT-PCR和免疫荧光验证表达，并在体内确认hEGFR表达。
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在模拟当前和未来临床试验的小鼠肿瘤模型中，靶向人EGFR的近红外光免疫治疗
Near-infrared photoimmunotherapy targeting human-EGFR in a mouse tumor model simulating current and future clinical trials.
实验完整度
高包含体外细胞杀伤实验、体内荷瘤模型、流式细胞术、免疫组化、四聚体分析、CD8+细胞耗竭实验、记忆免疫再挑战实验等多层级验证。
主要模型
mEERL-hEGFR细胞系 C57BL/6小鼠皮下荷瘤模型
重点核对
mEERL-hEGFR细胞系，hEGFR表达验证（RT-PCR、免疫荧光、流式） NIR光剂量：690 nm，150 mW/cm2，50 J/cm2 APC剂量：pan-IR700或抗CD25-F(ab′)2-IR700为50 μg/只（联合组）或100 μg/只（单药组） 治疗时间：肿瘤接种后第6天静脉注射APC，随后进行NIR光照射
摘要
背景：近红外光免疫治疗（NIR-PIT）是一种癌症治疗方法，使用抗体-光吸收剂（IRDye700DX，IR700）偶联物（APCs），其与靶细胞结合并被近红外光光激活，诱导快速坏死性细胞死亡。靶向人表皮生长因子受体（hEGFR）的NIR-PIT已被证明能摧毁表达hEGFR的人肿瘤细胞，并在免疫缺陷小鼠模型中有效。NIR-PIT还可靶向肿瘤微环境中的细胞，例如，CD25靶向的NIR-PIT可用于选择性清除肿瘤内的调节性T细胞（Tregs）。本研究旨在评估在新建立的表达hEGFR的鼠口咽细胞系（mEERL-hEGFR）中，hEGFR和CD25靶向的NIR-PIT联合治疗的效果。方法：帕尼单抗偶联IR700（pan-IR700）作为NIR-PIT的癌细胞导向组分，抗CD25-F(ab′)2-IR700作为NIR-PIT的肿瘤微环境导向组分。使用荷瘤小鼠在四组中评估疗效：（1）非治疗组（对照），（2）基于pan-IR700的NIR-PIT（pan-PIT），（3）基于抗CD25-F(ab′)2-IR700的NIR-PIT（CD25-PIT），（4）pan-IR700和抗CD25-F(ab′)2-IR700联合NIR-PIT（联合PIT）。结果：联合PIT组显示出最大的肿瘤生长抑制。癌细胞的破坏可能引发免疫反应，该反应因肿瘤微环境中Tregs的缺失而放大。解释：联合hEGFR和CD25靶向的NIR-PIT是治疗表达hEGFR且Treg细胞发挥免疫抑制作用的癌症的一种有前景的方法。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 联合hEGFR和CD25靶向的NIR-PIT在免疫活性小鼠模型中，对表达hEGFR的肿瘤是否比单药治疗更有效？
- 核心机制
- hEGFR靶向NIR-PIT诱导癌细胞免疫原性死亡，释放肿瘤相关抗原；CD25靶向NIR-PIT清除肿瘤内Tregs，解除免疫抑制，从而增强CD8+ T细胞介导的抗肿瘤免疫反应。
- 主要证据
- 在mEERL-hEGFR皮下荷瘤模型中，联合PIT显著抑制肿瘤生长，增加CD8+ T细胞浸润和CD8+/Treg比率，提高肿瘤特异性四聚体阳性CD8+ T细胞百分比，且联合PIT治愈的小鼠能排斥肿瘤再接种。
- 研究意义
- 该研究提供了一种可行的联合NIR-PIT策略，通过同时靶向癌细胞和肿瘤内Tregs，为治疗hEGFR表达且Tregs浸润的癌症提供了新方法。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外验证pan-IR700的特异性结合和细胞毒性
确认pan-IR700特异性结合mEERL-hEGFR细胞，并评估NIR-PIT的体外杀伤效果。
流式细胞术检测pan-IR700与细胞的结合（竞争抑制实验验证特异性）；显微镜观察NIR-PIT后的细胞形态变化；PI染色流式定量分析细胞死亡率。
体内评估pan-PIT的抗肿瘤效果
在mEERL-hEGFR荷瘤小鼠中评估hEGFR靶向NIR-PIT的疗效。
建立皮下肿瘤模型，静脉注射pan-IR700，进行NIR光照射，监测肿瘤生长和生存期；检测700nm荧光评估药物积累和光漂白。
分析肿瘤内CD25表达以评估CD25-PIT的针对性
确定CD25在肿瘤浸润淋巴细胞中的表达模式，以预测CD25靶向NIR-PIT的选择性。
通过流式细胞术分析mEERL-hEGFR肿瘤中CD25在CD4+ T细胞亚群、CD8+ T细胞、NK细胞等中的表达。
评估联合NIR-PIT的体内疗效
比较联合PIT与单药PIT对肿瘤生长和生存期的影响。
将荷瘤小鼠随机分为对照组、pan-PIT组、CD25-PIT组和联合PIT组，给予相应APC和NIR光照，监测肿瘤生长、生存期、肿瘤清除率，并分析治疗后1小时肿瘤组织学变化及Treg耗竭。
分析治疗后免疫反应
评估联合NIR-PIT对抗肿瘤免疫反应的影响，包括CD8+ T细胞浸润、记忆T细胞分化和肿瘤特异性T细胞。
治疗7天后，通过多重免疫组化分析肿瘤内CD8+ T细胞密度；流式分析引流淋巴结中CD8+ T细胞亚群（TCM等）；四聚体检测肿瘤特异性CD8+ T细胞（E7和p15E）。
验证免疫记忆
检验联合NIR-PIT是否诱导长期免疫记忆。
将联合PIT治愈的小鼠（10周后）对侧再接种mEERL-hEGFR细胞，观察肿瘤是否被排斥。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| APC合成 | IR700-NHS酯 | LI-COR Biosciences | 929-70011 |
| 帕尼单抗 | Amgen | RRID AB_2459650 | |
| 抗小鼠CD25抗体（克隆PC-61.5.3） | Bio X Cell | BE0012 | |
| Sephadex G25柱（PD-10） | GE Healthcare | -- | |
| 细胞系构建 | In-Fusion HD克隆试剂盒 | Clontech | 102518 |
| Polyfect转染试剂 | Qiagen | 301107 | |
| 细胞培养 | DMEM/F-12培养基 | Thermo Fisher Scientific | 1320033 |
| 胎牛血清 | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
| 青霉素/链霉素 | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| 人角质形成细胞生长添加物 | Thermo Fisher Scientific | S0015 | |
| 胰蛋白酶 | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| 流式分析 | 抗人IgG-PE | Thermo Fisher Scientific | 12-4998-82 |
| FACSLyric流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| FlowJo软件 | BD Biosciences | -- | |
| 体外NIR-PIT | ML7710激光系统 | Modulight | -- |
| IX81显微镜 | Olympus America | -- | |
| 体内荧光成像 | Pearl成像仪 | LI-COR Bioscience | -- |
| 流式分析 | IV型胶原酶 | Thermo Fisher Scientific | 17104019 |
| DNase I | Millipore Sigma | 11284932001 | |
| 70 μm细胞筛网 | Corning | 431751 | |
| 抗CD3e抗体（克隆145-2C11） | Biolegend | 100306 | |
| 抗CD8α抗体（克隆53-6.7） | Biolegend | 100734 | |
| 抗CD31抗体（克隆390） | Biolegend | 102420 | |
| 抗CD45抗体（克隆30F-11） | Biolegend | 103108 | |
| 抗hEGFR抗体（克隆AY13） | Biolegend | 352903 | |
| 抗CD4抗体（克隆RM4-5） | Thermo Fisher Scientific | 14-0042-85 | |
| 抗CD25抗体（克隆PC61.5） | Thermo Fisher Scientific | 17-0251-82 | |
| 抗CD44抗体（克隆IM7） | Thermo Fisher Scientific | 12-0441-83 | |
| 抗CD62L抗体（克隆MEL-14） | Thermo Fisher Scientific | 17-0621-82 | |
| 抗NK1.1抗体（克隆PK136） | Thermo Fisher Scientific | 45-5941-82 | |
| LIVE/DEAD可固定死细胞染料 | Thermo Fisher Scientific | L-34974 | |
| 可固定活力染料 | Thermo Fisher Scientific | 65-0866-14 | |
| Foxp3转录因子染色缓冲液套装 | Thermo Fisher Scientific | 00-5523-00 | |
| 抗Foxp3抗体（克隆FJK-16s） | Thermo Fisher Scientific | 17-5773-82 | |
| FACSCalibur流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| 四聚体分析 | 抗小鼠CD16/32抗体（克隆93） | Biolegend | 101301 |
| iTag H-2Db HPV 16 E7四聚体 | MBL International | TB-5008-1 | |
| H-2Kb p15E四聚体 | MBL International | TB-M507-1 | |
| H-2Kb Ova四聚体 | MBL International | TB-5001-1 | |
| 抗小鼠CD45.2抗体（克隆104） | Biolegend | 109815 | |
| 抗CD8抗体（克隆KT15） | MBL | D271-A64 | |
| SYTOX蓝色染料 | Thermo Fisher Scientific | S34857 | |
| 多重免疫荧光染色 | 西妥昔单抗 | Eli Lilly & Co. | -- |
| AlexaFluor 488二抗 | Invitrogen | A11013 | |
| 抗hEGFR抗体（克隆EGFR.1） | BD Biosciences | 555996 | |
| 抗活化hEGFR抗体（克隆13/EGFR） | BD Biosciences | 610025 | |
| 抗CD8抗体（克隆EPR20305） | Abcam | ab209775 | |
| 抗CD4抗体（克隆EPR 19514） | Abcam | ab221775 | |
| 抗Foxp3抗体（克隆1054C） | Novus Biologicals | MAB8214 | |
| 抗泛细胞角蛋白抗体（兔多克隆） | Bioss Antibodies | bs-1712R | |
| 体内CD8耗竭 | 抗小鼠CD8抗体（克隆YTS 169.4） | Bio X Cell | BE0117 |
| 大鼠IgG2b同型对照（克隆LTF-2） | Bio X Cell | BE0090 | |
| 统计分析 | GraphPad Prism软件 | GraphPad Software | -- |
| 细胞鉴定 | DAPI | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞系建立 | mEERL-hEGFR细胞克隆的选择标准（hEGFR表达水平），zeocin筛选浓度（500 μg/mL），培养条件（DMEM/F-12+10% FBS等）。 阅读提示：Methods 2.3 Cell lines |
| APC合成 | 抗体与IR700 NHS酯的摩尔比（5倍摩尔过量），反应时间（1小时），pH（8.5），纯化方式（Sephadex G25柱）。 阅读提示：Methods 2.1-2.2 Reagents, APC合成 |
| 体外NIR-PIT | pan-IR700浓度（10 μg/mL），孵育时间（1小时），NIR光参数（690 nm，150 mW/cm2，0-64 J/cm2），细胞数量（2×10^4或3×10^5）。 阅读提示：Methods 2.5 In vitro NIR-PIT |
| 动物模型 | 小鼠品系（C57BL/6，6-8周龄雌性），细胞接种量（1×10^6），接种部位（右侧背部），肿瘤体积测量公式（长径×短径^2×0.5）。 阅读提示：Methods 2.6 Animals and tumor models |
| 体内NIR-PIT | APC注射剂量（pan-IR700或抗CD25-F(ab′)2-IR700：单药100 μg，联合50 μg/只），注射时间（肿瘤接种后第6天），NIR光参数（690 nm，150 mW/cm2，50 J/cm2），治疗次数（2次）。 阅读提示：Methods 2.8 In vivo NIR-PIT; 结果图3(a) |
| 免疫分析 | 肿瘤消化用胶原酶IV浓度（1 mg/mL）和DNase I浓度（20 μg/mL），流式抗体克隆和浓度，四聚体种类和浓度，多重免疫荧光染色抗体稀释比例。 阅读提示：Methods 2.9-2.11 Flow-cytometric analysis, Tetramer assay, Multicolor immunofluorescence staining |