关节腔内注射人脐带间充质干细胞通过抑制软骨降解和炎症改善碘乙酸单钠诱导的大鼠骨关节炎

Intra-articular injection of human umbilical cord mesenchymal stem cells ameliorates monosodium iodoacetate-induced osteoarthritis in rats by inhibiting cartilage degradation and inflammation.

作者信息Quan Zhang, E Xiang, Wei Rao, Ya Qi Zhang, Cui Hong Xiao, Chang Yong Li, Bing Han, Dongcheng Wu
PMID33739851
发布时间2021-03
DOI10.1302/2046-3758.103.BJR-2020-0206.R2

实验完整度

包含体外干细胞表征、大鼠疾病模型体内疗效评估、组织学与免疫组化验证、qRT-PCR和ELISA检测,功能验证与机制验证并存。

主要模型

大鼠MIA诱导的膝骨关节炎模型(Wistar大鼠) 人脐带间充质干细胞(UC-MSCs)体外培养体系

重点核对

大鼠品系:雄性Wistar大鼠,体重180-200g MIA剂量与给药方式:1.0 mg/50μl单次关节腔内注射 UC-MSCs治疗剂量与方案:2.5×10^5 cells/50μl,每周一次,共三次 对照组设置:正常组、OA组(生理盐水50μl)、OA+HA组(0.5mg/50μl) 检测时间点:MIA注射后2周开始治疗,末次治疗后2周取材

摘要

目的:本研究旨在探讨人脐带间充质干细胞(UC-MSCs)是否能预防关节软骨降解,并探讨其在碘乙酸单钠(MIA)诱导的大鼠骨关节炎(OA)模型中的潜在机制。方法:通过其表型和多向分化潜能对人UC-MSCs进行表征。在大鼠MIA诱导后两周,每周关节腔内注射一次人UC-MSCs,持续三周。通过苏木精-伊红染色、甲苯胺蓝染色、番红O-快绿染色和Mankin评分评估人UC-MSCs的治疗效果。通过免疫组织化学检测关节软骨损伤标志物以及促炎和抗炎标志物。结果:组织病理学分析显示,关节腔内注射人UC-MSCs显著抑制了OA的进展,表现为软骨降解减少、番红O染色增强和Mankin评分降低。免疫组织化学显示,人UC-MSC治疗下调了基质金属蛋白酶13(MMP13)和含血小板反应蛋白基序的解整合素金属蛋白酶5(ADAMTS-5)的表达,并增强了关节软骨中II型胶原和ki67的表达。此外,人UC-MSCs显著降低了白细胞介素(IL)-1β和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达,同时增加了TNF-α诱导蛋白6和IL-1受体拮抗剂的表达。结论:我们的结果表明,人UC-MSCs通过防止软骨降解、恢复软骨细胞增殖和抑制炎症反应来改善MIA诱导的OA,这暗示人UC-MSCs可能是治疗OA的一种有前景的策略。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
人脐带间充质干细胞能否通过抑制软骨降解和炎症改善大鼠碘乙酸单钠诱导的骨关节炎?
核心机制
人UC-MSCs通过下调软骨降解酶(MMP13和ADAMTS-5)的表达、恢复软骨细胞增殖(II型胶原和ki67上调),并抑制炎症反应(降低IL-1β和TNF-α,升高TSG-6和IL-1RA)来发挥治疗作用。
主要证据
在MIA诱导的大鼠OA模型中,UC-MSCs关节腔内注射后组织学染色显示软骨降解减少、Mankin评分降低;免疫组化显示MMP13和ADAMTS-5下调,II型胶原和ki67上调;qRT-PCR和ELISA证实促炎因子降低、抗炎因子升高。
研究意义
研究表明人UC-MSCs可能成为治疗OA的一种有前景的策略,并为临床应用中合适的剂量和方案提供了参考。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

人UC-MSCs的分离、扩增与表征

验证所用人UC-MSCs的干细胞特性,包括表面标志物和多向分化潜能。

从脐带分离原代UC-MSCs,培养至P5代,使用流式细胞术检测表面标志物,并通过成脂、成骨、成软骨诱导分化,结合染色和qRT-PCR验证分化能力。

2

建立大鼠MIA诱导的OA模型

通过关节腔内注射MIA建立大鼠膝骨关节炎模型,模拟人OA病理变化。

雄性Wistar大鼠麻醉后,右膝关节腔内注射1.0 mg/50 μl MIA,建立OA模型。

3

UC-MSCs治疗及对照设置

评价人UC-MSCs对MIA诱导OA的治疗效果,并与透明质酸处理及空白对照比较。

MIA注射后2周开始,每周一次关节腔内注射UC-MSCs、透明质酸或生理盐水,共3次,末次治疗2周后取材。

4

组织学与免疫组化评估

评估关节软骨的结构变化、基质成分和关键蛋白表达,以判断UC-MSCs的治疗效果和机制。

取材膝关节,进行脱钙、石蜡包埋、切片,行H&E、甲苯胺蓝、番红O/快绿染色,并用Mankin评分评估严重程度;免疫组化检测MMP13、ADAMTS-5、II型胶原、ki67、IL-1β、TNF-α、TSG-6、IL-1RA及人核抗体。

5

qRT-PCR和ELISA检测

定量检测软骨组织中炎症因子和抗炎因子的mRNA和蛋白水平,进一步验证UC-MSCs的抗炎机制。

从关节软骨提取RNA和蛋白,通过qRT-PCR检测IL-1β、TNF-α、TSG-6、IL-1RA的mRNA表达;通过ELISA检测IL-1β和TNF-α的蛋白水平。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
CD73抗体BioLegend344016
CD90抗体BioLegend328110
CD105抗体BioLegend323204
CD34抗体BioLegend343604
CD44抗体BioLegend103007
CD45抗体BioLegend304008
CD19抗体BioLegend302208
HLA-DR抗体BioLegend307606
流式细胞仪Beckman Coulter--
成脂分化培养基GibcoA10070
成软骨分化培养基GibcoA10071
成骨分化培养基GibcoA10072
油红OGibco--
茜素红Gibco--
阿利新蓝Gibco--
透明质酸----
ADAMTS-5抗体Bioss1:200
MMP13抗体Bioss1:200
II型胶原抗体Bioss1:200
IL-1β抗体Bioss1:100
TSG-6抗体Bioss1:100
ki67抗体Abcam1:500
TNF-α抗体Proteintech1:200
抗人核抗体MAB1281Millipore1:100
IL-1RA抗体ABclonal1:100
TRIzol试剂Life Technologies--
PrimeScript逆转录试剂盒TaKaRa--
SYBR Green试剂Thermo Fisher Scientific--
CFX Connect实时荧光定量PCR仪Bio-Rad--
IL-1β ELISA试剂盒Mlbio--
TNF-α ELISA试剂盒Mlbio--
GraphPad Prism 5GraphPad Software--
SPSS v19.0IBM--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
UC-MSCs准备与表征
UC-MSCs代次(P5)、细胞表面标志物表达、多向分化潜能验证
阅读提示:Methods - Isolation and expansion of human UC-MSCs; Characterization of human UC-MSCs...
OA模型建立
大鼠品系、体重、MIA剂量、给药方式
阅读提示:Methods - Monosodium iodoacetate-induced osteoarthritis model
治疗干预
分组设置、细胞剂量、透明质酸剂量、治疗时间点及频率
阅读提示:Methods - Monosodium iodoacetate-induced osteoarthritis model; Figure 2
组织学与免疫组化评估
组织固定、脱钙、切片厚度、染色方法、Mankin评分标准、抗体稀释度
阅读提示:Methods - Histological analysis and immunohistochemistry; Figure 3-7
qRT-PCR和ELISA检测
RNA提取方法、引物序列、PCR条件、内参基因、ELISA试剂盒类型
阅读提示:Methods - Quantitative real-time polymerase chain reaction; ELISA; Supplementary Table i