鉴定Pex14p的有丝分裂磷酸化
确定Pex14p在哺乳动物细胞中是否被磷酸化，并验证其是否与细胞周期相关。
使用Phos-tag PAGE分析同步化的有丝分裂和间期HeLa及CHO-K1细胞中Pex14p的迁移模式，并用λ磷酸酶处理验证磷酸化特异性。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
Pex14p的有丝分裂磷酸化调控过氧化物酶体蛋白导入机制
Mitotic phosphorylation of Pex14p regulates peroxisomal import machinery.
实验完整度
高包含体外细胞实验、Pex5p导入/导出实验、Co-IP、BN-PAGE、磷酸化位点鉴定及构象分析等多个独立验证层级，功能与机制验证充分。
主要模型
HeLa细胞 CHO-K1细胞 Pex14缺陷HeLa细胞系
重点核对
HeLa和CHO-K1细胞以50 ng/ml nocodazole处理12–18小时并通过有丝分裂摇落法同步化 使用CDK1抑制剂RO-3306（9 µM）或CDK1 siRNA敲低验证CDK1介导的Pex14p磷酸化 通过CRISPR/Cas9系统生成Pex14基因敲除（pex14）HeLa细胞系 通过LC-MS/MS鉴定Pex14p在有丝分裂期的磷酸化位点（人Ser232，大鼠Ser334） 在体外Pex5p导入和导出实验中检测有丝分裂期Pex5p输出被抑制
摘要
过氧化物酶体基质蛋白通过膜结合的对接/转运机制被导入过氧化物酶体。该机制的一个核心组分是Pex14p，一种参与Pex5p（过氧化物酶体靶向信号1型（PTS1）的受体）对接的过氧化物酶体膜蛋白。对几种酵母菌的研究表明，Pex14p在体内被磷酸化，但在酵母和哺乳动物细胞中，Pex14p磷酸化的功能尚未被确定。在此，我们研究了有丝分裂期哺乳动物细胞中的过氧化物酶体蛋白导入及其动态。在有丝分裂停滞细胞中，Pex14p在Ser-232位点被磷酸化，导致过氧化氢酶（catalase）的导入效率降低，但不影响大多数蛋白质（包括经典的PTS1蛋白）的导入。由Pex14p的有丝分裂磷酸化诱导的构象变化更可能增加了同源相互作用亲和力，并抑制了其N端部分的拓扑变化，从而导致有丝分裂细胞中Pex5p输出的延迟。综上所述，这些数据表明，Pex14p的有丝分裂磷酸化以及随之而来的过氧化氢酶导入抑制，是在有丝分裂时核膜破裂后保护DNA的一种机制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 哺乳动物细胞中Pex14p的磷酸化是否调控有丝分裂期过氧化物酶体基质蛋白导入，其机制是什么？
- 核心机制
- CDK1介导的Pex14p在Ser232的磷酸化诱导其C端构象变化，增强同源寡聚稳定性，抑制N端拓扑变化，导致Pex5p输出延迟，从而抑制过氧化氢酶导入。
- 主要证据
- 使用磷酸化模拟突变S232D在pex14 HeLa细胞中抑制PTS1和过氧化氢酶导入；半透化细胞导入实验中磷酸酶处理恢复导入；体外Pex5p导入/导出实验显示有丝分裂期Pex5p输出受阻。
- 研究意义
- 揭示了过氧化物酶体蛋白导入受信号转导通路调控的首次证据；有丝分裂期抑制过氧化氢酶导入可能通过提高胞质过氧化氢酶水平保护DNA免受氧化损伤。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
定位有丝分裂磷酸化位点
鉴定Pex14p在有丝分裂期的具体磷酸化位点。
通过免疫沉淀富集Pex14p，结合TiO2富集磷酸化肽段和LC-MS/MS分析，鉴定了人Pex14p的Ser232和大鼠Pex14p的Ser334。
验证CDK1介导的磷酸化
确定哪种激酶负责Pex14p的有丝分裂磷酸化。
使用CDK1抑制剂RO-3306处理有丝分裂HeLa细胞，并利用siRNA敲低CDK1，通过Phos-tag PAGE检测Pex14p磷酸化水平的改变。
磷酸化模拟突变体对过氧化物酶体蛋白导入的影响
探究Pex14p磷酸化对PTS1蛋白和过氧化氢酶导入的影响。
在pex14 HeLa细胞中表达野生型或磷酸化模拟突变体S232D、S334D，通过免疫荧光分析PTS1和过氧化氢酶的导入效率。
半透化细胞导入实验
直接验证有丝分裂细胞中Pex14p磷酸化对PTS1蛋白导入的抑制。
使用毛地黄皂苷半透化的HeLa细胞，与EGFP-PTS1和Pex5pS共孵育，观察不同细胞周期阶段的导入情况，并对比λ磷酸酶处理的效果。
体外Pex5p导入和导出实验
评估有丝分裂是否影响Pex5p的导入和输出。
利用PNS组分进行体外Pex5p导入实验，随后进行导出实验，通过SDS-PAGE和Phos-tag PAGE分析Pex5p的分布。
Pex14p二聚化和构象分析
确定磷酸化如何影响Pex14p的寡聚状态和构象。
使用Co-IP和BN-PAGE分析野生型和S232D突变体的二聚化；通过蛋白酶K有限消化评估磷酸化对构象的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
验证分子表达变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞同步化 | 诺考达唑 | -- | -- |
| 磷酸酶处理 | λ蛋白磷酸酶 | New England Biolabs | -- |
| CDK1抑制 | RO-3306 | -- | -- |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| Ham's F-12培养基 | -- | -- | |
| 转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| 电穿孔 | NEPA21超级电穿孔仪 | Neppa Gene | -- |
| 免疫沉淀 | SureBeads Protein G磁珠 | Bio-Rad | -- |
| 蛋白酶解 | 胰蛋白酶/Lys-C混合酶 | Promega | -- |
| 质谱分析 | Q Exactive Plus质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| EASY-nLC 1200超高效液相色谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| C18反相色谱柱 | Nikkyo Technos | -- | |
| 抗体 | 抗Pex14p抗体 | -- | -- |
| 抗FLAG抗体（F7425） | Sigma-Aldrich | F7425 | |
| 抗GFP抗体 | MBL | -- | |
| 抗CDK1抗体 | Abcam | -- | |
| 抗磷酸化组蛋白H3（Ser10）抗体（D2C8） | Cell Signaling Technology | D2C8 | |
| 抗GAPDH抗体（3E12） | Bioss | 3E12 | |
| 抗HA抗体（16B12） | Covance | 16B12 | |
| 抗His6抗体（34660） | Qiagen | 34660 | |
| 免疫沉淀 | 抗Flag M2琼脂糖凝胶 | Sigma-Aldrich | -- |
| siRNA转染 | MISSION siRNA | Sigma-Aldrich | -- |
| CRISPR基因编辑 | pX330载体 | Addgene | -- |
| 免疫沉淀 | 蛋白A琼脂糖凝胶 | GE Healthcare | -- |
| 体外导入/导出实验 | TNT快速偶联转录/翻译系统 | Promega | -- |
| [35S]甲硫氨酸 | Amersham Biosciences | -- | |
| [35S]半胱氨酸 | Amersham Biosciences | -- | |
| Western blot | 聚偏二氟乙烯膜 | Bio-Rad | -- |
| ECL Western印迹检测试剂 | GE Healthsciences | -- | |
| BN-PAGE | 4-16% Bis-Tris凝胶 | Invitrogen | -- |
| 免疫荧光 | Alexa Fluor 488荧光染料 | Invitrogen | -- |
| Alexa Fluor 568荧光染料 | Invitrogen | -- | |
| 显微镜 | Axioscop显微镜 | Zeiss | -- |
| LSM510激光共聚焦显微镜 | Zeiss | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养和同步化 | HeLa和CHO-K1细胞的培养条件，同步化使用50 ng/ml nocodazole处理12–18小时，并通过有丝分裂摇落法收集 阅读提示：参见Materials and methods中Cell culture, DNA transfection, and cell synchronization部分 |
| 磷酸化位点鉴定 | 免疫沉淀条件，LC-MS/MS分析参数，磷酸化位点 阅读提示：参见Materials and methods中LC-MS/MS-based identification of Pex14p phosphorylation sites部分 |
| CDK1抑制或敲低 | RO-3306浓度（9 µM）和处理时间（0–60分钟），siRNA敲低效率（>90%） 阅读提示：参见Materials and methods中Treatment with λ protein phosphatase and CDK1 inhibitor和siRNA transfection部分 |
| 过氧化物酶体蛋白导入实验 | 在pex14 HeLa细胞中表达突变体，转染后24小时分析，PTS1和过氧化氢酶阳性细胞百分比 阅读提示：参见Materials and methods中Morphological analysis部分 |
| 半透化细胞导入实验 | 半透化条件（digitonin），EGFP-PTS1和Pex5pS用量，孵育温度和时间 阅读提示：参见Materials and methods中In vitro peroxisomal Pex5p import and export assays部分及图3C说明 |
| 体外Pex5p导入和导出实验 | PNS制备、[35S]标记Pex5pL、导入反应条件（26°C 1小时）、导出反应条件（含3 mM ATP，26°C 30分钟） 阅读提示：参见Materials and methods中In vitro peroxisomal Pex5p import and export assays部分 |
| 二聚化和构象分析 | Co-IP用抗体，BN-PAGE分析条件，蛋白酶K浓度和处理时间 阅读提示：参见Materials and methods中Coimmunoprecipitation assay和Protease digestion assay部分，以及图6和图7说明 |