PMECs的分离与鉴定
获取并验证猪肺微血管内皮细胞。
从仔猪肺分离PMECs,使用0.2% II型胶原酶消化,差速贴壁纯化,并通过PECAM-1免疫荧光鉴定。
Susceptibility of porcine pulmonary microvascular endothelial cells to porcine reproductive and respiratory syndrome virus.
研究包含原代细胞分离培养、免疫荧光、qRT-PCR和病毒滴定等实验,验证了PMECs对PRRSV的易感性,但缺乏动物模型或功能机制验证。
猪肺微血管内皮细胞(PMECs) MARC-145细胞
PMECs分离自约10日龄无特定病原体仔猪肺 PRRSV HN株接种剂量为每孔0.1毫升 感染后观察CPE至7天 qRT-PCR检测PRRSV N基因表达,时间点包括24、48、72、96小时 病毒滴定使用MARC-145细胞,重复八次
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
获取并验证猪肺微血管内皮细胞。
从仔猪肺分离PMECs,使用0.2% II型胶原酶消化,差速贴壁纯化,并通过PECAM-1免疫荧光鉴定。
确定PMECs上PRRSV受体的表达情况。
采用间接免疫荧光检测CD151、CD163和CD169的表达。
评估PRRSV感染PMECs后是否产生细胞病变。
PMECs感染PRRSV HN株或模拟感染,每日观察细胞形态并记录。
确认PRRSV在PMECs中的感染。
通过免疫荧光检测PRRSV GP5和N蛋白。
定量评估PRRSV在PMECs中的复制效率。
使用qRT-PCR检测PRRSV N基因表达。
评估从PMECs释放的PRRSV的感染性。
收集感染PMECs和MARC-145细胞的上清液,在MARC-145细胞上进行滴定。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 病毒培养 | 杜氏改良Eagle培养基(DMEM) | Gibco | H2387 |
| 胎牛血清(FBS) | Gibco | 10099-141 | |
| 细胞培养 | II型胶原酶 | Worthington Biochemical | LS004174 |
| 细胞鉴定 | 抗PECAM-1抗体 | Abcam | ab186720 |
| 免疫荧光 | 抗PRRSV GP5多克隆抗体 | Bioss | bs-4504R |
| 抗PRRSV N多克隆抗体 | Bioss | 23941R | |
| 抗CD151抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-18753-R | |
| 抗CD163抗体 | AbD Serotec | MCA2311GA | |
| 抗CD169抗体 | AbD Serotec | MCA2316GA | |
| FITC标记的二抗 | Bioss | bs-0296G-FITC | |
| qRT-PCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596026 |
| M-MLV逆转录酶 | Takara | 2641A |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| PMECs分离与培养 | 仔猪日龄及SPF状态、胶原酶浓度及消化时间、细胞培养基成分、培养条件 阅读提示:Materials and Methods - Cell culture |
| 病毒扩增 | 病毒株来源、MARC-145细胞培养条件、病毒接种量和培养时间 阅读提示:Materials and Methods - Virus |
| CPE观察 | 细胞代次、接种孔板、每孔接种量、感染时间、维持培养基成分、观察时间点 阅读提示:Materials and Methods - Cytopathic effects |
| 受体检测 | 抗体种类及稀释度、固定时间、细胞培养条件 阅读提示:Materials and Methods - Immunofluorescence |
| 病毒抗原检测 | 感染时间点、抗体种类、固定和染色条件 阅读提示:Materials and Methods - Immunofluorescence |
| qRT-PCR | 引物序列、RNA提取时间点、反转录条件、PCR循环参数 阅读提示:Materials and Methods - Quantitative reverse transcription PCR |
| 病毒滴定 | 细胞代次、感染时间点、上清液收集时间和重复数、滴定细胞 阅读提示:Materials and Methods - Virus titration |