猪肺微血管内皮细胞对猪繁殖与呼吸综合征病毒的易感性

Susceptibility of porcine pulmonary microvascular endothelial cells to porcine reproductive and respiratory syndrome virus.

作者信息Peishan Li, Zhongjin Yang, Shun Ma, Ge Hu, Hong Dong, Tao Zhang
PMID32830156
发布时间2020-10-07
DOI10.1292/jvms.20-0324

实验完整度

研究包含原代细胞分离培养、免疫荧光、qRT-PCR和病毒滴定等实验,验证了PMECs对PRRSV的易感性,但缺乏动物模型或功能机制验证。

主要模型

猪肺微血管内皮细胞(PMECs) MARC-145细胞

重点核对

PMECs分离自约10日龄无特定病原体仔猪肺 PRRSV HN株接种剂量为每孔0.1毫升 感染后观察CPE至7天 qRT-PCR检测PRRSV N基因表达,时间点包括24、48、72、96小时 病毒滴定使用MARC-145细胞,重复八次

摘要

微血管内皮细胞具有多种功能,其在多种病毒感染中的作用已有文献记载。猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染会导致仔猪严重的肺部炎症损伤,表现为肺内皮功能障碍。然而,PRRSV影响猪肺微血管内皮细胞(PMECs)的潜在机制仍不清楚。本研究旨在评估PMECs对PRRSV的易感性。从仔猪肺中分离纯化原代PMECs,并使用免疫荧光技术表征三种PRRSV受体的表达。PRRSV HN株在PMECs中于感染后第五天出现明显的细胞病变效应,并通过免疫荧光和定量RT-PCR在RNA和蛋白质水平上检测到PMECs中的PRRSV抗原。病毒抗原在感染后96小时显著增加,并从感染PMECs的上清液中回收到了感染性病毒。结果表明,PMECs可被PRRSV HN株感染,且其受体表达模式与肺泡巨噬细胞不同。本研究结果揭示了PMECs在PRRSV感染中的潜在作用,并为其严重表现的发病机制提供了全面的理解。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
猪肺微血管内皮细胞(PMECs)是否对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)易感?
核心机制
PMECs可被PRRSV HN株感染,其受体表达模式与肺泡巨噬细胞不同,仅检测到CD151表达,未检测到CD163和CD169,推测感染机制可能与巨噬细胞不同。
主要证据
原代PMECs感染PRRSV HN株后,出现细胞病变效应,免疫荧光检测到GP5和N蛋白,qRT-PCR显示N基因表达在96小时显著升高,且上清液中分离到感染性病毒。
研究意义
首次证明猪肺微血管内皮细胞对PRRSV易感,为理解PRRSV感染和发病机制提供新见解。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

PMECs的分离与鉴定

获取并验证猪肺微血管内皮细胞。

从仔猪肺分离PMECs,使用0.2% II型胶原酶消化,差速贴壁纯化,并通过PECAM-1免疫荧光鉴定。

2

PRRSV受体表达检测

确定PMECs上PRRSV受体的表达情况。

采用间接免疫荧光检测CD151、CD163和CD169的表达。

3

细胞病变效应观察

评估PRRSV感染PMECs后是否产生细胞病变。

PMECs感染PRRSV HN株或模拟感染,每日观察细胞形态并记录。

4

病毒抗原检测

确认PRRSV在PMECs中的感染。

通过免疫荧光检测PRRSV GP5和N蛋白。

5

病毒复制动力学检测

定量评估PRRSV在PMECs中的复制效率。

使用qRT-PCR检测PRRSV N基因表达。

6

病毒滴定

评估从PMECs释放的PRRSV的感染性。

收集感染PMECs和MARC-145细胞的上清液,在MARC-145细胞上进行滴定。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

验证样本或模型特征
验证病毒复制和感染性
数据分析与统计

产品清单

实验环节名称品牌货号
杜氏改良Eagle培养基(DMEM)GibcoH2387
胎牛血清(FBS)Gibco10099-141
II型胶原酶Worthington BiochemicalLS004174
抗PECAM-1抗体Abcamab186720
抗PRRSV GP5多克隆抗体Biossbs-4504R
抗PRRSV N多克隆抗体Bioss23941R
抗CD151抗体Santa Cruz Biotechnologysc-18753-R
抗CD163抗体AbD SerotecMCA2311GA
抗CD169抗体AbD SerotecMCA2316GA
FITC标记的二抗Biossbs-0296G-FITC
TRIzol试剂Invitrogen15596026
M-MLV逆转录酶Takara2641A

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
PMECs分离与培养
仔猪日龄及SPF状态、胶原酶浓度及消化时间、细胞培养基成分、培养条件
阅读提示:Materials and Methods - Cell culture
病毒扩增
病毒株来源、MARC-145细胞培养条件、病毒接种量和培养时间
阅读提示:Materials and Methods - Virus
CPE观察
细胞代次、接种孔板、每孔接种量、感染时间、维持培养基成分、观察时间点
阅读提示:Materials and Methods - Cytopathic effects
受体检测
抗体种类及稀释度、固定时间、细胞培养条件
阅读提示:Materials and Methods - Immunofluorescence
病毒抗原检测
感染时间点、抗体种类、固定和染色条件
阅读提示:Materials and Methods - Immunofluorescence
qRT-PCR
引物序列、RNA提取时间点、反转录条件、PCR循环参数
阅读提示:Materials and Methods - Quantitative reverse transcription PCR
病毒滴定
细胞代次、感染时间点、上清液收集时间和重复数、滴定细胞
阅读提示:Materials and Methods - Virus titration