THOR功能缺失验证
验证敲除lncRNA THOR对癌细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响。
利用CRISPR/Cas9和sgRNA构建hTHOR−/− H1299细胞系，通过qRT-PCR和Sanger测序确认敲除，评估细胞增殖、集落形成、迁移侵袭及体内成瘤能力。
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一种新的N6-甲基腺苷（m6A）依赖性长非编码RNA THOR的命运决定
A novel N6-methyladenosine (m6A)-dependent fate decision for the lncRNA THOR.
实验完整度
高包含体外细胞功能实验、体内异种移植瘤模型、m6A位点突变与回复实验、RIP和RNA pull-down等机制验证，证据层级丰富。
主要模型
H1299细胞系 hTHOR−/− H1299细胞系 METTL3stop/stop H1299细胞系 裸鼠异种移植瘤模型
重点核对
THOR基因敲除使用CRISPR/Cas9技术，sgRNA靶位点及敲除效率需核实 m6A位点突变（OE 6A-mutated）的构建及功能验证 YTHDF1和YTHDF2敲低对THOR表达的调控 体内实验使用雌性裸鼠（4周龄，18-20g），每组5只，皮下注射2×10^6细胞 RNA稳定性检测使用放线菌素D（5 μg/ml）处理
摘要
先前的研究已揭示长链非编码RNA（lncRNA）的N6-甲基腺苷（m6A）修饰在癌症中的关键作用，但致癌lncRNA THOR（癌症/睾丸lncRNA的代表）的致癌作用与m6A修饰之间的关系仍不清楚。在此，我们展示了lncRNA THOR的内部m6A修饰通过m6A阅读器依赖的方式调节癌细胞的增殖。我们的研究结果表明，lncRNA THOR的缺失在体内外抑制癌细胞的增殖、迁移和侵袭。此外，m6A在lncRNA THOR转录本上高度富集，其包含GA（m6A）CA、GG（m6A）CU和UG（m6A）CU序列基序。RIP-qRT-PCR和RNA pull-down实验结果显示，特异性m6A阅读器YTHDF1和YTHDF2能够读取m6A基序并调节lncRNA THOR的稳定性（稳定化和降解）。这些m6A依赖的RNA-蛋白质相互作用可以维持lncRNA THOR的致癌作用。总之，这些发现强调了m6A修饰在致癌lncRNA THOR中的关键作用，并揭示了一种新的长链非编码RNA调控机制，为未来探索RNA表观遗传调控模式提供了新途径。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 致癌lncRNA THOR的促癌作用是否依赖于m6A修饰，以及m6A修饰如何调控THOR的稳定性。
- 核心机制
- m6A修饰通过m6A阅读器YTHDF1和YTHDF2识别不同位点，平衡调节lncRNA THOR的稳定化和降解，从而维持其致癌作用。
- 主要证据
- 通过CRISPR/Cas9敲除THOR、m6A位点突变、MeRIP-qPCR、RIP-qPCR、RNA decay实验以及体内异种移植瘤模型，证实m6A修饰调控THOR稳定性并影响癌细胞增殖。
- 研究意义
- 首次揭示m6A修饰在致癌lncRNA THOR中的功能，提出一种“THOR-m6A-reader”新型调控机制，为探索RNA表观遗传调控模式提供新途径。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
m6A修饰及METTL3依赖性验证
验证m6A修饰在THOR转录本上的富集以及METTL3敲除对THOR表达和m6A水平的影响。
通过SRAMP工具预测m6A位点，构建METTL3stop/stop细胞系，通过MeRIP-qPCR和qRT-PCR检测THOR的m6A水平和表达。
m6A位点功能验证
确认m6A位点对THOR功能的影响，验证m6A修饰是否介导细胞增殖。
构建野生型（WT）和6A突变的THOR过表达载体，转染至hTHOR−/−细胞，建立稳定细胞系，检测增殖、迁移、侵袭和体内成瘤能力。
精确m6A位点定位及单突变分析
确定THOR上具体的m6A修饰位点及其对功能的影响。
通过MeRIP-qPCR确认位点，构建单点维持（Maintain）和单点突变（Mutation）细胞系，检测细胞增殖、迁移和体内成瘤能力。
m6A阅读器机制验证
验证YTHDF1和YTHDF2识别m6A位点并调节THOR稳定性的机制。
通过siRNA敲低YTHDF1或YTHDF2，检测THOR表达变化，利用RIP-qPCR验证结合，RNA decay实验测定稳定性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco Life Technologies | -- |
| RPMI 1640培养基 | Gibco Life Technologies | -- | |
| 胎牛血清 | Clark Bioscience | -- | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| 基因敲除 | PX458质粒 | Addgene | -- |
| 74707载体 | Addgene | -- | |
| 质粒构建 | pcDNA3.1_THOR质粒 | GenScript | -- |
| pcDNA3.1_mutTHOR质粒 | GenScript | -- | |
| Mut Express II快速突变试剂盒V2 | Vazyme | -- | |
| PB513B-1载体 | Miaolingbio | -- | |
| 质粒转染 | Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Thermo Fisher | 3778150 |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher | L3000015 | |
| 基因分型 | TIANamp基因组DNA提取试剂盒 | TIANGEN | -- |
| PCR扩增 | 2× PrimeSTAR Max预混液 | TaKaRa Bio | -- |
| 逆转录 | FastKing逆转录试剂盒（含gDNase） | Tiangen Biotech | -- |
| qPCR | SuperReal PreMix Plus（SYBR Green） | TIANGEN Biotech | -- |
| Bio-Rad Iq5多色实时荧光定量PCR检测系统 | Bio-Rad | -- | |
| 蛋白提取 | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 磷酸酶抑制剂 | Thermo Scientific | -- | |
| 蛋白定量 | 增强型BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | P0010 |
| Western blot | PVDF膜 | Millipore | -- |
| 脱脂奶粉 | Boster | AR0104 | |
| 软琼脂集落形成实验 | NuSieve GTG琼脂糖 | Lonza | 50081 |
| 迁移实验 | Transwell小室 | Corning | 3422 |
| 侵袭实验 | Matrigel基质胶 | BD Biosciences | -- |
| 伤口愈合实验 | 伤口愈合插件 | ibidi | -- |
| MeRIP | Magna MeRIP m6A试剂盒 | Sigma-Aldrich | -- |
| RNA pull-down | Pierce RNA 3'端脱硫生物素标记试剂盒 | Thermo Scientific | -- |
| Pierce磁性RNA-蛋白质pull-down试剂盒 | Thermo Scientific | -- | |
| RIP | YTHDF1抗体 | Proteintech | 17479-1-AP |
| YTHDF2抗体 | Proteintech | 24744-1-AP | |
| 细胞培养 | 氯化钠 | Sigma-Aldrich | -- |
| 氯化镁 | Sigma-Aldrich | -- | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | -- | |
| RNA酶抑制剂 | Thermo Fisher | -- | |
| 二硫苏糖醇 | Solarbio | -- | |
| RNA-FISH | 甲酰胺 | Sigma-Aldrich | -- |
| 柠檬酸钠缓冲液 | Solarbio | -- | |
| 硫酸葡聚糖 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 牛血清白蛋白 | Solarbio | -- | |
| 大肠杆菌tRNA | Merck | -- | |
| Fluor-594标记的山羊抗兔IgG | BIOSS | -- | |
| DAPI染色液 | Thermo Scientific | -- | |
| 蔡司LSM800共聚焦显微镜 | Zeiss | -- | |
| RNA干扰 | 小干扰RNA | GenePharma | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | H1299细胞培养于RPMI 1640培养基（含10%胎牛血清）；293T和A549细胞培养于DMEM（含10%胎牛血清）；需确认培养基和血清品牌。 阅读提示：Materials and methods, Cell culture |
| 基因敲除 | THOR敲除使用CRISPR/Cas9技术，sgRNA序列及PX458质粒；METTL3敲除使用BE4-Gam系统，靶向stop codon；需确认sgRNA序列和敲除效率。 阅读提示：Results, Fig.1a, b; Fig.2b |
| 过表达细胞系构建 | 使用PiggyBac转座系统，质粒包括OE WT、OE 6A-mutated、Maintain 1-6、Mutation 2-5等；需确认转染方法和筛选标记。 阅读提示：Materials and methods, Plasmid construction; Results, Fig.3a, b |
| 体外功能实验 | 集落形成实验（500细胞/孔）、软琼脂实验（10^4细胞/孔，0.35%琼脂）、迁移和侵袭实验（10^5细胞/孔，Transwell，迁移6h，侵袭24h）、伤口愈合实验（划痕后6、12、24h测量）；需确认细胞密度和检测时间。 阅读提示：Materials and methods, Plate formation assay, Migration and invasion assay, Wound-healing assay |
| 体内异种移植瘤模型 | 使用雌性裸鼠（4周龄，18-20g），每组5只，皮下注射2×10^6细胞，每周测量肿瘤大小，4-5周后处死；需确认小鼠品系和伦理审批。 阅读提示：Materials and methods, Xenograft tumours |
| MeRIP-qPCR | 使用Magna MeRIP m6A试剂盒，需要验证抗体效率和IP条件。 阅读提示：Materials and methods, Methylated RNA immunoprecipitation-qRT-PCR assay |
| RNA降解实验 | 使用放线菌素D（5 μg/ml）处理细胞，检测THOR半衰期；需确认作用时间。 阅读提示：Materials and methods, RNA decay assays |
| RIP-qPCR | 使用YTHDF1（Proteintech 17479-1-AP）和YTHDF2（Proteintech 24744-1-AP）抗体进行RIP；需确认抗体特异性和IP条件。 阅读提示：Materials and methods, RNA immunoprecipitation-qRT-PCR assay |