circRNA表达差异筛选
鉴定在肠道炎症中表达变化的circRNA，并筛选与ILC3功能相关的候选分子。
从DSS处理和对照Rag1−/−小鼠中分离ILC3，进行circRNA芯片分析，并对上调最显著的前10个circRNA进行qRT-PCR验证和功能筛选。
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诱导型环状RNA circKcnt2抑制ILC3活化以促进结肠炎消退
An inducible circular RNA circKcnt2 inhibits ILC3 activation to facilitate colitis resolution.
实验完整度
高包含circRNA芯片筛选、细胞功能实验、基因敲除小鼠模型、DSS诱导结肠炎及H.h.感染模型，并进行CHIRP、ChIP、RNA pulldown等机制验证，证据层级丰富。
主要模型
ILC3细胞（小鼠肠道） Rag1−/−小鼠（DSS诱导先天性结肠炎模型） circKcnt2−/−小鼠及其与Rag1−/−杂交小鼠 Rag1−/−Il2rg−/−小鼠（过继转移模型）
重点核对
circKcnt2在DSS处理小鼠ILC3中的表达时序（第6天达峰） circKcnt2−/−Rag1−/−小鼠DSS处理后的体重变化、结肠炎评分和生存率 circKcnt2与Batf启动子结合区域（-1800至-1600）及HR4结构 circKcnt2Mut小鼠中circKcnt2在Batf启动子的富集和Batf表达变化 Mbd3−/−Rag1−/−和circKcnt2−/−Batf−/−Rag1−/−小鼠的结肠炎表型
摘要
三型固有淋巴样细胞（ILC3）是肠道免疫、炎症和组织稳态的重要调节因子，但ILC3活化如何被调控仍不清楚。在这里，我们鉴定了一个新的环状RNA（circRNA）circKcnt2，它在肠道炎症期间于ILC3中被诱导表达。敲除circKcnt2导致小鼠肠道ILC3活化和严重的结肠炎。机制上，circKcnt2作为核内circRNA，招募核小体重塑去乙酰化酶（NuRD）复合物到Batf启动子上以抑制Batf表达；这进而抑制Il17表达，从而促进ILC3失活以促进先天性结肠炎消退。此外，Mbd3−/−Rag1−/−和circKcnt2−/−Rag1−/−小鼠在葡聚糖硫酸钠（DSS）处理后发展出严重的先天性结肠炎，而同时删除Batf则促进结肠炎消退。总之，我们的数据支持circRNA circKcnt2在调控ILC3失活和先天性结肠炎消退中的功能。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 环状RNA是否以及如何调控ILC3的活化，从而影响肠道炎症的消退？
- 核心机制
- circKcnt2作为核环状RNA，通过其HR4结构域与Batf启动子区域（-1800至-1600）结合，并招募NuRD复合物（通过Mbd3）至该位点，抑制Batf转录，进而下调Il17表达，抑制ILC3活化，促进先天性结肠炎消退。
- 主要证据
- circKcnt2在炎症ILC3中高表达；circKcnt2敲除导致ILC3活化、IL-17产生增加和严重结肠炎；CHIRP、ChIP、EMSA等证明circKcnt2与Batf启动子及Mbd3的相互作用；circKcnt2突变或Mbd3缺失破坏该抑制，加重结肠炎，而Batf缺失则促进消退。
- 研究意义
- 该研究揭示circRNA通过招募染色质重塑复合物调控ILC3功能的新机制，为肠道炎症疾病提供潜在的治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
circKcnt2表达与分布验证
确认circKcnt2的组织、细胞特异性表达，以及在炎症过程中的动态变化和亚细胞定位。
通过Northern blot、qRT-PCR检测circKcnt2在不同组织和免疫细胞中的表达；在DSS处理不同时间点检测其表达；通过FISH和核质分离检测其亚细胞定位。
circKcnt2敲除小鼠的构建与表型分析
研究circKcnt2在体内的生理功能，验证其敲除对ILC3活化及结肠炎的影响。
通过CRISPR/Cas9技术生成circKcnt2−/−小鼠，与Rag1−/−小鼠杂交，用DSS或H.h.处理，评估体重、结肠长度、结肠炎评分、IL-17+ ILC3数量、肠道通透性（FITC-dextran）等指标。
过继转移及抗IL-17抗体实验
证明circKcnt2在ILC3中作用的重要性，以及IL-17在circKcnt2介导的炎症调控中的关键作用。
将circKcnt2+/+或circKcnt2−/− ILC3s（或circKcnt2Mut等）过继转移至Rag1−/−Il2rg−/−小鼠，随后DSS处理，并使用抗IL-17抗体或同型对照，评估结肠炎严重程度。
分子机制解析
阐明circKcnt2抑制Batf转录的分子机制，包括与Batf启动子的结合及NuRD复合物的招募。
通过转录组芯片、CHIRP、RNA pulldown、EMSA、ChIP、DNaseI accessibility、nuclear run-on等实验，证明circKcnt2与Batf启动子结合，并通过Mbd3招募NuRD复合物，导致Batf启动子区域染色质封闭，抑制转录。
功能验证与回路验证
验证circKcnt2-Batf-IL-17轴对ILC3活化和结肠炎的影响，并通过基因敲除/回补实验确认因果关系。
利用circKcnt2Mut小鼠、Mbd3−/−小鼠、Batf−/−小鼠及组合小鼠（如circKcnt2−/−Batf−/−Rag1−/−），在DSS或H.h.模型中观察ILC3活化、IL-17产生和结肠炎表型，通过过表达或敲除实验验证circKcnt2功能。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
评估体内效果
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 抗体染色 | 抗H3K27ac抗体 | Cell Signaling Technology | 8173 |
| 抗Batf抗体 | Cell Signaling Technology | 8638 | |
| 抗H3K27me3抗体 | Cell Signaling Technology | 9733 | |
| 抗Mbd3抗体 | Cell Signaling Technology | 99169 | |
| 抗Chd3抗体 | Cell Signaling Technology | 4241 | |
| 抗Rbap46抗体 | Cell Signaling Technology | 6882 | |
| 抗Hdac1抗体 | Cell Signaling Technology | 34589 | |
| 抗Hdac2抗体 | Cell Signaling Technology | 57156 | |
| 抗EEA1抗体 | Cell Signaling Technology | 3288 | |
| 抗H3抗体 | Cell Signaling Technology | 4499 | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 3700 | |
| 抗Kcnt2抗体 | Bioss Antibodies | bs-12177R | |
| 流式分析 | 抗CD127抗体 (A7R34) | eBiosciences | -- |
| 抗c-Kit抗体 (2B8) | eBiosciences | -- | |
| 抗CD3抗体 (17A2) | eBiosciences | -- | |
| 抗CD4抗体 (GK1.5) | eBiosciences | -- | |
| 抗CD19抗体 (1D3) | eBiosciences | -- | |
| 抗NK1.1抗体 (PK136) | eBiosciences | -- | |
| 抗CD150抗体 (mShad150) | eBiosciences | -- | |
| 抗CD34抗体 (RAM34) | eBiosciences | -- | |
| 抗CD45抗体 (30-F11) | eBiosciences | -- | |
| 抗CD90抗体 (HIS51) | eBiosciences | -- | |
| 抗Sca-1抗体 (D7) | eBiosciences | -- | |
| 抗CD25抗体 (PC61.5) | eBiosciences | -- | |
| 抗Flt3抗体 (A2F10) | eBiosciences | -- | |
| 抗α4β7抗体 (DATK32) | eBiosciences | -- | |
| 抗RORγt抗体 (AFKJS-9) | eBiosciences | -- | |
| 抗NKp46抗体 (29A1.4) | eBiosciences | -- | |
| 抗Gata3抗体 (TWAJ) | eBiosciences | -- | |
| 抗KLRG1抗体 (2F1) | eBiosciences | -- | |
| 抗PLZF抗体 (Mags.21F7) | eBiosciences | -- | |
| 谱系混合抗体 (88-7772-72) | eBiosciences | 88-7772-72 | |
| 抗CD48抗体 (HM48-1) | eBiosciences | -- | |
| 抗IL-17抗体 (eBio17B7) | eBiosciences | -- | |
| 抗CD16/32抗体 (93) | eBiosciences | -- | |
| 免疫沉淀 | 抗BrdU抗体 (600-401-C29) | Thermo Fisher | 600-401-C29 |
| 细胞核染色 | DAPI | Sigma-Aldrich | -- |
| ELISA | IL-17 ELISA试剂盒 | eBiosciences | -- |
| RNA提取 | RNA小量制备试剂盒 | Tiangen | -- |
| 逆转录 | M-MLV逆转录酶 | Promega | -- |
| qPCR | ABI 7300实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- |
| circRNA芯片 | 小鼠环状RNA芯片V2.0 | -- | -- |
| mRNA芯片 | Affymetrix mRNA表达谱芯片 | Affymetrix | -- |
| RNA杂交 | Hybond-N+膜 | GE Healthcare | -- |
| DNaseI敏感性分析 | 细胞核分离试剂盒 | Sigma-Aldrich | -- |
| EMSA | Light Shift化学发光RNA EMSA试剂盒 | Thermo Scientific | -- |
| 细胞培养 | HEK293T细胞 | ATCC | CRL-11268 |
| H.h.感染 | 肝螺杆菌 (Hh NCI-Frederick 1A株) | American Type Culture Collection | 51449 |
| H.h.培养 | 血琼脂平板 | Oxoid | -- |
| H.h. DNA提取 | 粪便DNA提取试剂盒 | Qiagen | -- |
| 流式分选 | FACSAria III流式分选仪 | BD Biosciences | -- |
| 显微镜 | Olympus FV1200激光共聚焦显微镜 | Olympus | -- |
| Olympus FV1000激光共聚焦显微镜 | Olympus | -- | |
| 质谱 | LTQ Orbitrap XL质谱仪 | Thermo Scientific | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| circRNA筛选与验证 | DSS处理剂量（3%）、时间（7天）、小鼠品系（Rag1−/−）、ILC3分选标记（Lin−CD90highCD45low） 阅读提示：Fig. 1a-c及Methods部分 |
| circKcnt2敲除小鼠构建 | CRISPR/Cas9靶向序列、sgRNA序列、敲除效率验证 阅读提示：Methods: Generation of knockout mice; Supplementary Table 2 |
| DSS诱导结肠炎实验 | DSS浓度（3%）、处理天数（7天）、小鼠周龄（约8周）、恢复期（7天） 阅读提示：Methods: DSS-induced colitis |
| 过继转移实验 | ILC3数量（3×10^4）、受体小鼠品系（Rag1−/−Il2rg−/−）、移植后等待时间（2周）、DSS处理 阅读提示：Methods: Adoptive transfer assay |
| 分子机制实验 | CHIRP探针序列、ChIP抗体（H3K27ac、H3K27me3、Mbd3等）、DNaseI处理条件 阅读提示：Methods: Chromatin immunoprecipitation assay, DNaseI accessibility assay |