患者样本收集和准备
获取CRS和对照患者的黏膜组织样本，用于后续染色和分析。
从CRS患者前筛窦和下鼻甲肥大对照患者收集组织样本，固定于4%甲醛，石蜡包埋，切片。
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通过免疫荧光多通道图像细胞计量学表征人上呼吸道黏膜中的上皮细胞、结缔组织细胞和免疫细胞：一项初步研究
Characterization of epithelial cells, connective tissue cells and immune cells in human upper airway mucosa by immunofluorescence multichannel image cytometry: a pilot study.
实验完整度
中研究包含患者样本（CRS vs 对照）的体外组织学分析，并进行了共表达验证（如EMT细胞通过共聚焦确认），但缺乏功能验证或机制验证。
主要模型
人上呼吸道黏膜FFPE组织样本（CRS患者和对照）
重点核对
样本类型：FFPE组织样本，来自前筛窦（CRS）或下鼻甲（对照） 抗体组合：泛细胞角蛋白、波形蛋白、CD45/CD18直接偶联抗体，用于细胞谱系鉴定 图像分析：TissueFAXS采集，StrataQuest分析，使用细胞/背景比率区分阳性/阴性 对照：同型对照用于阴性对照，单染样本用于补偿通道串扰 统计：SPSS 26.0，非参数检验（Wilcoxon符号秩检验）
摘要
上皮细胞、结缔组织细胞和免疫细胞以不同方式参与慢性鼻窦炎（CRS）的病理生理过程。然而，关于它们在上呼吸道黏膜中分布的数据很少。我们旨在提供这些细胞谱系分布及其共表达模式的定量、纯粹信息性数据，这可能有助于识别，例如，经历上皮间质转化（EMT）的上皮细胞。为此，我们使用了免疫荧光多通道图像细胞计量学（IMIC）。我们检查了6例慢性鼻窦炎（CRS）患者和3例无CRS（对照组）患者的固定石蜡包埋组织样本（FFPE）。使用直接偶联抗体泛细胞角蛋白、波形蛋白和CD45/CD18进行上皮层和固有层中的共表达分析。图像采集和分析分别使用TissueFAXS和StrataQuest进行。为了区分阳性和阴性表达，开发了细胞特异性免疫染色强度与背景之间的比率。使用同型对照作为阴性对照。每位患者扫描4.5 mm2的组织区域，识别出中位数14,875个细胞。最常见的细胞类型是细胞角蛋白单阳性（26%）、波形蛋白单阳性（13%）和CD45/CD18单阳性以及CD45/CD18-波形蛋白双阳性细胞（29%）。在CRS患者中，CD45/CD18单阳性细胞比对照组高3-6倍。在上皮层中，CRS患者的细胞角蛋白-波形蛋白双阳性EMT细胞比对照组高3-5倍。本研究提供了CRS中关键细胞类型分布的定量数据。未来的研究可能侧重于CRS甚至癌症组织中不同免疫细胞的分布和共表达模式。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 免疫荧光多通道图像细胞计量学（IMIC）能否提供人上呼吸道黏膜中上皮细胞、结缔组织细胞和免疫细胞分布及共表达模式的定量数据？
- 核心机制
- 慢性鼻窦炎中上皮-间质转化（EMT）相关细胞（细胞角蛋白-波形蛋白双阳性）和免疫细胞（CD45/CD18单阳性）比例增加。
- 主要证据
- 基于6例CRS和3例对照的FFPE组织样本，通过IMIC定量分析，显示CRS患者中CD45/CD18单阳性细胞和EMT细胞比例显著升高。
- 研究意义
- 该技术可能有助于未来研究CRS和癌症组织中不同免疫细胞的分布和共表达模式，可能支持个性化治疗和预后评估。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
免疫荧光染色
检测上皮、结缔组织和免疫细胞的标记物及其共表达。
使用直接偶联的抗体（pan-cytokeratin, vimentin, CD45/CD18）和DAPI核染色进行四通道免疫荧光染色，并使用同型对照和单染样品进行阴性对照和补偿。
图像采集
高分辨率采集免疫荧光图像，用于定量分析。
使用TissueFAXS PLUS系统（40×空气镜）采集图像，使用PCO pixelfly CCD相机（14位动态范围），并通过软件自动拼接。
图像分析（细胞分割和量化）
识别细胞核和细胞质，计算每个细胞的标记物强度，并区分阳性和阴性细胞。
使用StrataQuest软件进行核分割（DAPI通道）和细胞质分割（每个通道），并使用自定义的细胞/背景比率定义阳性，生成细胞群体百分比。
统计分析
比较CRS组和对照组之间细胞群体差异。
使用SPSS 26.0进行非参数检验（Wilcoxon符号秩检验），比较上皮层和固有层的细胞比例。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 组织脱水 | 微波组织处理器石蜡包埋系统（Histos 5） | Milestone | -- |
| 切片 | HM 355S切片机 | Microm | -- |
| Superfrost Plus载玻片 | Menzel | -- | |
| 免疫染色 | 抗原修复液（Cell Conditioning Solution CC1） | Ventana | 950-124 |
| 泛细胞角蛋白抗体（Alexa Fluor 488） | Biolegend | 628,608 | |
| 波形蛋白抗体（eFluor 570） | Invitrogen | 41-9897-82 | |
| CD45抗体（Alexa Fluor 594） | Biolegend | 304,060 | |
| CD18抗体（Alexa Fluor 594） | Bioss Antibodies | BS-3264R-A594 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 自发荧光淬灭 | TrueVIEW自发荧光淬灭试剂盒 | Vector Laboratories | SP-8400 |
| 封片 | Vectashield vibrance M封片剂 | Vector Laboratories | VECH-1700 |
| 图像采集 | TissueFAXS PLUS系统 | TissueGnostics | -- |
| 蔡司Axio Imager Z2显微镜 | Zeiss | 3523 | |
| PCO pixelfly CCD相机 | PCO AG | 9070000310 | |
| X-Cite 120Q荧光光源 | Lumen Dynamics | -- | |
| 图像分析 | StrataQuest软件 | TissueGnostics | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 样本收集 | 样本来源（前筛窦 vs 下鼻甲），患者类型（CRSsNP, CRSwNP, 对照），排除标准（术后、6周内使用类固醇） 阅读提示：Methods: Patient population |
| 组织处理 | 固定液（4%甲醛），脱水程序，切片厚度（5μm） 阅读提示：Methods: Embedding and cutting |
| 免疫染色 | 抗体稀释（pan-cytokeratin 1:100, vimentin 1:100, CD45 1:100, CD18 1:200），DAPI 1:46000，抗原修复条件，孵育时间温度（37°C 1小时），自体荧光淬灭试剂盒的使用 阅读提示：Methods: Antigen retrieval, immunostaining and autofluorescence reduction; Table 1 |
| 图像采集 | 物镜（40×空气镜），相机（PCO pixelfly CCD 14位），扫描面积（约4.5 mm2/患者），平铺重叠（15%） 阅读提示：Methods: Image acquisition |
| 图像分析 | 核分割参数（<40 μm2和>100 μm2排除），细胞质分割参数（生长步长不同通道不同），细胞/背景比率计算 阅读提示：Methods: Image analysis, Nuclear segmentation, Cytoplasm segmentation, Background calculation |
| 统计分析 | 数据归一化，30%随机样本，使用95% CI上限定义阳性，统计检验（Wilcoxon符号秩检验） 阅读提示：Methods: Data analysis |