Foxa2eGFP小鼠构建与验证
生成用于追踪内胚层和肝细胞的转基因报告小鼠品系。
构建Foxa2eGFP小鼠，将eGFP连接到Foxa2第三外显子，通过免疫荧光验证eGFP表达与Foxa2一致。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
Foxa2eGFP小鼠中通过单细胞RNA测序揭示的胚胎肝脏发育轨迹
Embryonic liver developmental trajectory revealed by single-cell RNA sequencing in the Foxa2eGFP mouse.
实验完整度
高该研究包含多个证据层级：单细胞转录组、免疫荧光验证、轨迹分析及与外部数据集比较，并进行了功能相关分析（如LXR/RXR通路）。
主要模型
Foxa2eGFP小鼠胚胎（E7.5-E15.5） 原代内胚层和肝细胞 单细胞转录组数据（SMART-seq2和MIRALCS）
重点核对
Foxa2eGFP转基因小鼠模型 单细胞测序方法（SMART-seq2和MIRALCS） 细胞分选（BD FACSAriaTM III） E9.5-E10.5肝脏原基和胆囊原基的鉴定 EHT过程中六组基因的动态表达
摘要
肝脏和胆囊是内胚层衍生的最重要的内脏器官之一，但胚胎早期的肝脏和胆囊发育尚未完全了解。我们使用转基因Foxa2eGFP报告小鼠品系，对从E7.5到E15.5的十个胚胎阶段分离的内胚层和肝细胞进行了单细胞全长mRNA测序。我们确定了从肠道内胚层到肝母细胞的胚胎肝脏发育轨迹，并表征了肝谱系的转录组。更重要的是，我们确定了肝脏原基作为具有肠道和肝脏特征的早期肝脏祖细胞，并记录了在E9.5-11.5肝脏特化阶段上皮-肝脏转变（EHT）过程中的动态基因表达。我们发现在EHT过程中有六组基因被开启或关闭，包括多种先前未知在EHT期间表达的转录调控因子。此外，我们确定并揭示了E9.5胆囊原基的转录谱。目前的数据为理解肝脏和胆囊发育提供了高分辨率的资源和关键见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 本研究旨在揭示胚胎早期（E7.5至E15.5）肝脏和胆囊发育的转录组动态，特别是从肠道内胚层到肝母细胞的发育轨迹及肝脏特化过程。
- 核心机制
- 研究发现肝脏特化涉及上皮-肝脏转变（EHT），伴随六组基因（L1-L3、G1-G3）的程序性表达变化，LXR/RXR信号通路和转录因子如Lzts1的激活与肝脏特化相关。
- 主要证据
- 使用Foxa2eGFP小鼠进行单细胞全长mRNA测序，鉴定出肝母细胞、肝脏原基和胆囊原基，并通过免疫荧光验证了DLK1、LZTS1等标志物。
- 研究意义
- 数据提供了高分辨率的转录组资源，有助于理解肝脏和胆囊发育机制，并可能为肝移植的治疗性组织产生提供线索。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
单细胞分离与测序
获取高质量的单细胞转录组数据以描述发育轨迹。
从不同胚胎阶段解剖内胚层和肝组织，通过FACS分选Foxa2eGFP+细胞，使用SMART-seq2和MIRALCS方法进行全长mRNA测序。
细胞聚类和类型鉴定
定义不同发育阶段的细胞群并识别其分子特征。
使用Seurat进行聚类，基于标志基因表达鉴定原始条纹、内脏内胚层、肠道内胚层、神经管、肝细胞、胆囊原基等。
肝脏发育轨迹分析
揭示从肠道内胚层到肝母细胞及成熟肝细胞的动态过程。
使用Monocle2进行拟时序分析，结合E9.5-E15.5的细胞鉴定轨迹，并评估肝功能、干性和增殖评分。
EHT过程基因动态分析
鉴定肝脏特化期间（EHT）的基因表达变化。
比较肠道管、肝脏原基、肝芽和E11.5肝细胞的差异表达基因，聚类成六个基因群（L1-L3、G1-G3），并分析其功能和转录调控。
胆囊原基鉴定
确认胆囊原基的转录特征及其与肝脏原基的差异。
在E9.5识别Sox17+、Lgr4+、Pdx1-的胆囊原基细胞，并通过差异表达分析发现其特异性标志物。
验证和外部数据比较
验证本研究的发现并评估其普遍性。
通过免疫荧光验证关键蛋白（如LZTS1、DLK1）表达，并将EHT基因模式与公开数据集（Yang et al.和Cao et al.）比较。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 载体构建 | pEYFPC1 | -- | -- |
| pLEGFPC1 | -- | -- | |
| pEASY-Flox | -- | -- | |
| HiFi-PCR | -- | -- | |
| 细胞分选 | BD FACSAriaTM III | BD | -- |
| 单细胞扩增 | KAPA HiFi DNA聚合酶 | KAPA biosystems | -- |
| TSO引物 | Exiqon | -- | |
| Ampure XP磁珠 | Beckman | -- | |
| AccuBlue高灵敏度dsDNA定量试剂盒 | Biotium | -- | |
| 实时定量PCR | KAPA SYBR® FAST Universal 2X qPCR预混液 | KAPA biosystems | KK4600 |
| 7300或7500实时荧光定量PCR仪 | Applied Biosystems | -- | |
| 免疫荧光 | FOXA2抗体 | Cell Signaling | #3143 |
| DLK1抗体 | Abcam | ab21682 | |
| HNF4A抗体 | LSBio | LS-C413074 | |
| LZTS1抗体 | Bioss | bs-5705R | |
| Fluormount-G | -- | -- | |
| RNA-seq | BGISEQ-500测序仪 | BGI | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型 | Foxa2eGFP小鼠品系，C57BL/6背景，纯合子，胚胎发育阶段E7.5至E15.5 阅读提示：Methods: 小鼠饲养和解剖/定时交配和胚胎收集 |
| 单细胞分离和测序 | 分选策略（Foxa2eGFP+细胞），使用BD FACSAriaTM III，单细胞分选到96孔板，SMART-seq2和MIRALCS方法，建库测序平台BGISEQ-500 阅读提示：Methods: FACS，单细胞mRNA扩增，文库制备和BGISEQ-500测序 |
| 数据过滤和质量控制 | 细胞过滤标准：检测基因数≥6000（SMART-seq2），映射读段≥1M，映射率≥40% 阅读提示：Methods: 基因表达水平定量和测序数据评估 |
| 聚类分析 | Seurat聚类参数（PC数，分辨率）因阶段而异（E7.5-E8.5: 12 PCs, resolution 1; E9.5-E10.5: 5 PCs, resolution 0.8; E11.5-E15.5: 8 PCs, resolution 0.7） 阅读提示：Methods: 细胞聚类和标志基因鉴定 |
| 拟时序分析 | Monocle2参数：仅包含肝脏原基、肝芽和肝母细胞，差异表达基因q<0.001 阅读提示：Methods: 拟时序分析 |