建立体内APAP诱导肝损伤模型并检测p66Shc表达
确定APAP处理是否改变肝组织中p66Shc的表达。
C57BL/6小鼠腹腔注射APAP(300mg/kg)诱导肝损伤，24h后取肝组织，Western blot检测p66Shc蛋白水平。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
circ-CBFB上调p66Shc扰乱APAP诱导的肝损伤中的线粒体动力学
circ-CBFB upregulates p66Shc to perturb mitochondrial dynamics in APAP-induced liver injury.
实验完整度
高包含体内小鼠模型和体外细胞实验两个证据层级，并进行功能验证（敲低/过表达）和机制验证（miRNA靶向、泛素化、回复实验）。
主要模型
C57BL/6小鼠APAP诱导肝损伤模型 AML12小鼠肝细胞系
重点核对
APAP剂量：300 mg/kg（体内）和5 mM（体外） 给药方式：腹腔注射（体内）；细胞处理（体外） 处理时间：24小时（体内和体外） 敲低序列：p66Shc、miR-185-5p、circ-CBFB的shRNA/siRNA序列 统计方法：t检验或单因素方差分析，P<0.05
摘要
p66Shc是线粒体活性氧（mtROS）的主要调节因子，是肝细胞氧化应激的关键介质。然而，其在APAP诱导的肝损伤中的功能贡献及其调节机制仍不清楚。在此，我们旨在评估p66Shc对APAP诱导的肝损伤的影响，并评估环状RNA（circRNA）是否作为竞争性内源RNA（ceRNA）在APAP诱导的肝损伤中介导p66Shc。给p66Shc、miR-185-5p和circ-CBFB沉默的小鼠注射APAP。AML12细胞在APAP刺激前转染p66Shc、miR-185-5p和circ-CBFB沉默或过表达质粒或siRNA。APAP处理后，肝组织中p66Shc上调，体内p66Shc沉默可保护小鼠免受APAP诱导的线粒体动力学紊乱和肝损伤。体外p66Shc敲低减轻了线粒体动力学紊乱和APAP诱导的肝细胞损伤。机制上，p66Shc部分通过抑制OMA1泛素化扰乱线粒体动力学。通过微阵列和生物信息学分析鉴定出miR-185-5p直接抑制p66Shc翻译，其过表达在体外减轻了线粒体动力学紊乱和肝细胞损伤。此外，荧光素酶、pull-down和RNA免疫沉淀实验证明circ-CBFB作为miR-185-5p的miRNA海绵在APAP诱导的肝损伤中介导p66Shc。circ-CBFB敲低也减轻了APAP诱导的线粒体动力学紊乱和肝细胞损伤。更重要的是，我们发现circ-CBFB敲低对p66Shc、线粒体动力学和肝损伤的保护作用在体内外均被miR-185-5p抑制所消除。总之，p66Shc是APAP诱导肝损伤的关键调节因子，通过触发线粒体动力学紊乱起作用。circ-CBFB作为ceRNA在APAP诱导的肝损伤中调节p66Shc，这可能提供一个潜在的治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- p66Shc在APAP诱导的肝损伤中是否起作用以及其调节机制；circRNA是否作为ceRNA介导p66Shc。
- 核心机制
- p66Shc通过抑制OMA1泛素化、增加OMA1表达，进而促进线粒体裂变，扰乱线粒体动力学；circ-CBFB作为miR-185-5p的海绵，解除其对p66Shc的翻译抑制，上调p66Shc。
- 主要证据
- 在C57BL/6小鼠和AML12细胞中，p66Shc敲低减轻APAP诱导的线粒体动力学紊乱和肝损伤；OMA1泛素化水平增加；MG132回复线粒体碎片化；mito-TEMPO清除mtROS消除p66Shc过表达效应；荧光素酶、pull-down和RIP实验证明circ-CBFB与miR-185-5p直接结合；miR-185-5p抑制回复circ-CBFB敲低效应。
- 研究意义
- circ-CBFB和p66Shc可能作为APAP诱导肝损伤的潜在治疗靶点，拓宽治疗选择。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体内p66Shc敲低对APAP诱导肝损伤的影响
评估p66Shc沉默是否影响APAP诱导的线粒体动力学紊乱和肝损伤。
通过尾静脉注射lentivirus-p66Shc-shRNA敲低p66Shc，7天后APAP处理，检测肝损伤指标（ALT/AST、H2O2、GSH、MDA）、组织学（H&E）、线粒体形态（TEM）和线粒体动力学相关蛋白（OMA1、OPA1、MFN2、DRP1）。
体外p66Shc敲低/过表达对APAP诱导肝细胞损伤的影响
验证p66Shc在肝细胞中的作用及其对线粒体动力学的影响。
AML12细胞转染si-p66Shc或pcDNA-p66Shc，然后APAP处理，检测H2O2、蛋白表达（p66Shc、OMA1、OPA1等）、mtROS（MitoSOX）、凋亡（TUNEL）、线粒体形态（TOM20染色）和OMA1泛素化。
机制探究：p66Shc通过miR-185-5p和OMA1泛素化调节线粒体动力学
阐明p66Shc调节线粒体动力学的分子机制。
通过miRNA微阵列和生物信息学预测miR-185-5p为p66Shc上游调节因子；用qRT-PCR检测miR-185-5p表达；用agomir/antagomir改变miR-185-5p水平检测p66Shc蛋白；用双荧光素酶报告实验验证miR-185-5p直接靶向p66Shc-3'UTR；检测OMA1泛素化水平；用MG132和mito-TEMPO处理验证泛素化和mtROS的作用。
circ-CBFB的鉴定及其与miR-185-5p的相互作用
确定circ-CBFB是否作为ceRNA吸附miR-185-5p。
通过circRNA预测软件筛选候选circRNA，qRT-PCR验证APAP处理后circ-CBFB上调；通过核质分离、FISH、RNase R处理验证circ-CBFB的环状性和胞质定位；通过RNA pull-down、荧光素酶和RIP验证circ-CBFB与miR-185-5p的直接结合。
体外circ-CBFB敲低及miR-185-5p抑制对APAP诱导肝细胞损伤的影响
验证circ-CBFB通过miR-185-5p调节p66Shc和线粒体动力学。
AML12细胞共转染si-circ-CBFB和ant-185，APAP处理后检测蛋白表达（p66Shc、OMA1等）、线粒体碎片化（TOM20）和细胞损伤。
体内circ-CBFB敲低及miR-185-5p抑制对APAP诱导肝损伤的影响
在体内验证circ-CBFB通过miR-185-5p调节APAP诱导的肝损伤。
小鼠分别注射lentivirus-circ-CBFB-shRNA和/或lentivirus-miR-185-5p-inhibitor，7天后APAP处理，检测肝损伤指标（ALT/AST、GSH、MDA）、组织学（H&E）、线粒体形态（TEM）和蛋白表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- | |
| 药物处理 | MG132 | Selleck | -- |
| Mito-TEMPO | Sigma | -- | |
| Ruboxistaurin | Selleck | -- | |
| Western blot | p66Shc抗体 | BD Biosciences | 610878 |
| p-p66Shc抗体 | Bioss | bs-3410R | |
| CYP2E1抗体 | Proteintech | 19937-1-AP | |
| OMA1抗体 | Santa | sc-515788 | |
| OPA1抗体 | Proteintech | 27733-1-AP | |
| MFN2抗体 | Bioss | bs-23685R | |
| DRP1抗体 | Wanleibio | WL03028 | |
| p-DRP1抗体 | Abcam | ab193216 | |
| β-actin抗体 | Proteintech | 60008-1-Ig | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| qRT-PCR | PrimeScript™ RT试剂盒 | TaKaRa | -- |
| SYBR Premix EX Taq™ ii | TaKaRa | -- | |
| 免疫荧光 | DAPI | Beyotime Institute of Biotechnology | -- |
| MitoSOX染色 | MitoSOX Red | Invitrogen | -- |
| Hoechst 33342 | Beyotime Institute of Biotechnology | -- | |
| TUNEL染色 | 凋亡检测试剂盒 | KeyGEN BioTECH | KGA704 |
| 透射电镜 | 透射电子显微镜 | JEOL | -- |
| 线粒体分离 | 哺乳动物线粒体分离试剂盒 | TransGen Biotech | -- |
| RNA免疫沉淀 | RNA结合蛋白免疫沉淀试剂盒 | Millipore | -- |
| 抗Argonaute 2抗体 | Abcam | ab32381 | |
| 正常小鼠IgG | Millipore | -- | |
| RNA pull-down | M-280链霉亲和素磁珠 | Invitrogen | -- |
| RNase R处理 | RNase R | GENESEED | -- |
| 核质分离 | PARIS试剂盒 | Invitrogen | -- |
| FISH | RNA FISH试剂盒 | GenePharma | -- |
| 荧光素酶报告实验 | 双荧光素酶报告基因试剂盒 | TransGene Biotech | -- |
| 病理检测 | ALT/AST检测试剂盒 | Jiancheng Corp. | -- |
| GSH/MDA/H2O2检测试剂盒 | Jiancheng Corp. | -- | |
| 荧光显微镜 | 80i尼康显微镜 | Nikon | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型建立 | 小鼠品系、性别、年龄、体重；APAP剂量（300mg/kg）、给药途径、处理时间；动物分组及样本量（12只/组）；敲低病毒类型（lentivirus-shRNA）及注射剂量（1×10^9 viral particles/mouse）、注射途径（尾静脉）、预处理时间（7天） 阅读提示：Materials and methods: APAP-induced liver injury in vivo; Figure legends (Fig. 1) |
| 细胞培养与处理 | AML12细胞培养条件（DMEM:F12, 10% FBS, insulin, transferrin, selenium, dexamethasone）；转染试剂（Lipofectamine 3000）及时间（48h）；APAP浓度（5mM）及处理时间（24h） 阅读提示：Materials and methods: Cell culture and transfection; Figure legends (Fig. 2) |
| Western blot | 裂解液、蛋白定量方法、上样量、一抗稀释比例、二抗来源、ECL显色方法 阅读提示：Materials and methods: Western blotting |
| 线粒体动力学检测 | TEM样本制备（固定、包埋、切片）、MitoSOX染色条件（10min, 37°C）、TUNEL试剂盒、TOM20染色 阅读提示：Materials and methods: Transmission electron microscopy, MitoSOX staining, TUNEL staining; Figure legends (Fig. 2) |
| RNA pull-down和RIP | biotin标记miR-185-5p mimic序列、突变序列；AGO2抗体；磁珠类型；裂解buffer 阅读提示：Materials and methods: RNA immunoprecipitation and pull-down assays |