动物模型与样本收集
获取不同尾型绵羊的尾部脂肪组织，以比较蛋白质表达差异。
选取5个中国地方绵羊品种（3个肥尾品种和2个瘦尾品种），每个品种3只雄性羔羊，于出生时选取，在相似环境下饲养，于40±10天（体重13-15kg）时屠宰，采集尾部/臀部中间位置的脂肪组织。
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定量蛋白质组学分析鉴定中国瘦尾和肥尾羔羊尾部/臀部脂肪沉积中的差异表达蛋白
Quantitative proteomic analysis identified differentially expressed proteins with tail/rump fat deposition in Chinese thin- and fat-tailed lambs.
实验完整度
高包含多品种脂肪组织蛋白质组学、RT-qPCR、Western blot、免疫组化和免疫荧光等多层级验证，以及脂肪细胞形态学分析。
主要模型
哈萨克羊（肥臀羊）尾部脂肪组织 兰州大尾羊（长脂尾）尾部脂肪组织 湖羊（短脂尾）尾部脂肪组织 高山美利奴羊（长瘦尾）尾部脂肪组织 藏羊（短瘦尾）尾部脂肪组织
重点核对
5个品种，每个品种3只雄性羔羊（出生时选取，未断奶，40±10天，体重13-15kg） 尾部脂肪组织样本采集位置：尾部/臀部中间 蛋白质组学：无标记定量，差异蛋白筛选标准为p<0.05且倍数变化≥2 RT-qPCR内参基因：GAPDH Western blot验证蛋白：FABP4, ACSL1, ATGL, HSD17β4等
摘要
尾部脂肪作为重要的功能组织之一，能增强绵羊对恶劣环境的耐受性。本研究的目的是深入了解该性状的潜在发育机制。本研究采用无标记定量蛋白质组学方法，对中国地方肥尾羊（哈萨克羊、湖羊和兰州大尾羊）和瘦尾羊（高山美利奴羊、藏羊）的绵羊尾部/臀部脂肪组织中的蛋白质丰度进行了定量分析。结果表明，在五个品种中共鉴定出3400种蛋白质，其中804种为差异表达蛋白质，包括在肥尾羊和瘦尾羊的尾部脂肪组织中638种上调蛋白质和83种下调蛋白质，所有差异表达蛋白质的表达模式被区分为8个簇。差异表达蛋白质主要与代谢途径和过氧化物酶体增殖物激活受体信号通路相关。此外，通过实时荧光定量PCR和Western Blot验证了蛋白质组学结果。我们的研究还表明，尾部脂肪组织中上调的蛋白质ACSL1、HSD17β4、FABP4可能通过促进脂肪细胞增殖和脂肪积累而有助于绵羊尾部/臀部的脂肪沉积。特别是，在肥尾中高表达的FABP4将对尾部脂肪沉积起重要作用。我们的研究可能为理解绵羊和其他动物身体特殊部位的脂肪积累提供新的视角。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 绵羊尾部脂肪沉积的分子机制是什么？
- 核心机制
- PPAR信号通路中上调的FABP4、ACSL1、HSD17β4等蛋白质通过促进脂肪细胞增殖和脂肪酸转运，进而促进尾部脂肪沉积。
- 主要证据
- 对五个品种羔羊尾部脂肪组织的无标记定量蛋白质组学分析鉴定出804个DEPs，并通过RT-qPCR、Western blot、免疫组化和免疫荧光验证了关键蛋白（如FABP4）的表达和定位。
- 研究意义
- 为绵羊尾部脂肪沉积的分子机制提供新见解，并为未来该性状的临床和基础研究提供理论基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
脂肪组织形态学分析
比较肥尾与瘦尾绵羊脂肪细胞大小差异，初步评估脂肪积累能力。
对尾部脂肪组织进行石蜡包埋、切片、油红O染色，在显微镜下观察脂肪细胞形态并测量细胞直径。
蛋白质组学分析
鉴定肥尾与瘦尾绵羊尾部脂肪组织中差异表达的蛋白质。
提取脂肪组织蛋白质，酶解后使用LC-MS/MS进行无标记定量蛋白质组学分析，通过PEAKS软件进行数据库搜索和定量，最终鉴定出804个差异表达蛋白质。
生物信息学分析
对差异表达蛋白质进行功能注释和通路富集，以揭示其参与的生物学过程。
使用g:Profiler进行GO富集分析，使用KOBAS软件进行KEGG通路富集分析，并对所有差异蛋白进行聚类分析。
RT-qPCR验证
在mRNA水平验证蛋白质组学鉴定的差异表达蛋白。
提取相同脂肪组织样本的RNA，逆转录后使用SYBR Green进行RT-qPCR，检测24个候选基因的表达，并以GAPDH作为内参。
Western blot验证
在蛋白水平验证蛋白质组学鉴定的关键差异蛋白。
对FABP4、ACSL1、ATGL、HSD17β4、ERK2、PRKACA、COL1A1等蛋白进行Western blot检测，以β-actin为内参。
免疫组化和免疫荧光分析
确定FABP4蛋白在尾部脂肪组织中的定位和表达水平。
对藏羊（瘦尾）和湖羊（肥尾）的尾部脂肪组织切片进行FABP4免疫组化和免疫荧光染色，观察其在毛细血管壁的表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 脂肪组织染色 | OTC冷冻包埋剂 | SAKURA | -- |
| 冷冻切片机 | Leica | CM 1860UV | |
| 光学显微镜 | Olympus | BX43 | |
| 图像分析系统 | cellSens | -- | |
| 蛋白质提取 | 胰蛋白酶 | Promega | -- |
| 真空离心浓缩仪 | Marin Christ | RVC 2-18 | |
| LC-MS/MS分析 | 纳升高效液相色谱系统 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| QExactive四极杆-静电场轨道阱质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Xcalibur软件 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| RT-qPCR | 天根试剂盒 | Tiangen Bio | -- |
| Takara Ex Taq试剂盒 | Takara Bio | -- | |
| SYBR Green预混液 | Takara | RR420A | |
| CFX 96实时荧光定量PCR仪 | Bio-Rad | -- | |
| Western blot | ECL化学发光试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 抗COL1A1抗体 | Abcam | ab138492 | |
| 抗ACSL1抗体 | Abcam | ab177958 | |
| 抗ERK2抗体 | Abcam | ab32081 | |
| HSD17β4抗体 | Proteintech | 15116-1-AP | |
| FABP4抗体 | Proteintech | 12802-1-AP | |
| PKA C-alpha抗体 | Proteintech | 55388-1-A | |
| ATGL抗体 | Proteintech | 55190-1-AP | |
| β-actin抗体 | Shenggong | -- | |
| 免疫组化和免疫荧光 | 抗兔IgG二抗 | Biyuntian | A0208 |
| 免疫荧光 | AlexaFluor-488偶联小鼠IgG | Bioss | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型 | 品种选择：3个肥尾品种（哈萨克羊、兰州大尾羊、湖羊）和2个瘦尾品种（高山美利奴羊、藏羊）；每个品种3只雄性羔羊，出生时选取，未断奶；饲养条件：与母羊同栏，补充碎玉米和干苜蓿，自由采食饮水；屠宰时月龄：40±10天，体重13-15kg；采样时间：2014年4月20日至4月28日。 阅读提示：Materials and methods: Animals, adipose tissues collection and ethics |
| 蛋白质组学 | 蛋白质提取方法：氯仿/甲醇（1:2）去脂后，尿素裂解缓冲液提取；LC-MS/MS参数：QExactive质谱仪，梯度洗脱120分钟；数据搜索：PEAKS软件，数据库为Ovis aries蛋白质序列；差异蛋白筛选标准：p<0.05且倍数变化≥2。 阅读提示：Materials and methods: Protein extraction of adipose tissues and peptide preparation; LC-MS/MS analysis; Quantitative proteomic analysis |
| RT-qPCR | RNA提取试剂盒：天根试剂盒；逆转录试剂盒：Takara Ex Taq Kit；检测系统：CFX 96；引物序列：见S1 Table；内参基因：GAPDH；反应条件：20 μl体系，含2 μl cDNA，10 μl SYBR Green Master Mix；生物学重复：3次。 阅读提示：Materials and methods: Quantitative real-time PCR (RT-qPCR) analysis; S1 Table |
| Western blot | 抗体及稀释比例：COL1A1 (1:10000)、ACSL1 (1:10000)、ERK2 (1:10000) (Abcam)；HSD17β4 (1:2000)、FABP4 (1:1000)、PKA C-alpha (1:1000)、ATGL (1:2000) (Proteintech)；β-actin (1:1000) (Shenggong)；上样量未明确说明。 阅读提示：Materials and methods: Western blot analysis |
| 免疫组化和免疫荧光 | 组织切片：厚度12 μm（原文如此）；FABP4一抗稀释比例：1:1000；二抗：anti-rabbit IgG (A0208, Biyuntian) 和AlexaFluor-488标记小鼠IgG (Bioss)；孵育时间：一抗4°C过夜，二抗室温1小时。 阅读提示：Materials and methods: Immunohistochemistry and immunofluorescence analysis; Figure 5 legend |